張?jiān)品?，趙 森，常 靖，任昕昕，王愛(ài)華，趙 鵬，董林沛，吳小軍，張景然，劉冰潔

(1.公安部物證鑒定中心,北京 100038；2.浙江警察學(xué)院 浙江省毒品防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310053；3.愛(ài)博才思亞太應(yīng)用支持中心，北京 100015)

草甘膦和草銨膦是一類(lèi)非選擇性、內(nèi)吸型除草劑，在我國(guó)農(nóng)業(yè)、林業(yè)中應(yīng)用廣泛，其生產(chǎn)量和使用量均位于世界前列[1]。草甘膦和草銨膦的毒性不大，但具有致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此受到社會(huì)越來(lái)越多的關(guān)注。此外，投毒、誤服、自殺等原因的中毒(案)事件也時(shí)有發(fā)生[2-3]，因此草甘膦和草銨膦在涉毒案件的檢驗(yàn)鑒定工作中需求較大。建立生物體液(血液、尿液)中此類(lèi)除草劑的檢測(cè)方法可為案件的定性和偵破提供技術(shù)支持，為臨床毒物分析及救治提供參考依據(jù)[4]。

草甘膦和草銨膦進(jìn)入人體后會(huì)發(fā)生代謝，草甘膦的代謝產(chǎn)物為氨甲基膦酸、N-乙酰草甘膦、N-甲基草甘膦；草銨膦的代謝產(chǎn)物為N-乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亞基丙酸、N-乙酰草銨膦[5-6]。草甘膦、草銨膦及兩者的代謝物均為強(qiáng)極性化合物，易溶于水。目前血液和尿液中草甘膦、草銨膦及代謝物的檢測(cè)方法主要有分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、離子色譜法[11]、離子色譜-質(zhì)譜法[12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[13]等。其中，分光光度法的專(zhuān)屬性差，難以滿(mǎn)足毒物分析特異性強(qiáng)、定性準(zhǔn)確的要求；高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法需進(jìn)行衍生，操作復(fù)雜、不易控制、重現(xiàn)性差；離子色譜法易受生物基質(zhì)影響，重現(xiàn)性差，適用范圍窄。HPLC-MS/MS法具有靈敏度高、分析范圍廣、分析時(shí)間短等特點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于毒物分析領(lǐng)域[14-15]。然而，目前已報(bào)道的血液中草甘膦的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法存在靈敏度偏低、基質(zhì)干擾大、樣本與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間不一致等缺點(diǎn)，難以滿(mǎn)足臨床及刑偵、司法鑒定中對(duì)此類(lèi)除草劑的高靈敏度、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。

本研究以血液和尿液為研究對(duì)象，選擇8種極性農(nóng)藥及代謝物，包括草甘膦及其代謝物(氨甲基膦酸、N-乙酰草甘膦、N-甲基草甘膦)、草銨膦及其代謝物(N-乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亞基丙酸、N-乙酰草銨膦)，采用非衍生化方法，建立了生物體液中草甘膦、草銨膦及代謝物等8種極性農(nóng)藥的HPLC-MS/MS法，為解決草甘膦、草銨膦涉毒案(事)件提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

LC-30AD 高效液相色譜(日本Shimadzu公司)，配有Turbo VTM離子源的Triple Quad 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司)；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備。高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)；Vortex-Genie 2可調(diào)速渦旋混合器(美國(guó)SI公司)；電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；移液器和2 mL離心管(德國(guó)Eppendorf公司)；碳酸銨和碳酸氫銨(色譜純，Sigma公司)；Cleanert PEP Plus固相萃取柱(60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司)。

草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸、N-乙酰草甘膦、N-甲基草甘膦、N-乙酰氨甲基磷酸、3-甲基磷酸亞基丙酸、N-乙酰草銨膦(純度>98%，德國(guó)LGC公司)；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific)；9 cm定性濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取各化合物固體標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光儲(chǔ)存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用純水稀釋得到，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

取0.2 mL樣品，加入0.2 mL水，混勻后加入0.6 mL乙腈，振蕩混勻，冷凍離心10 min，取上清液，依次過(guò)Cleanert PEP Plus固相萃取柱和0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，收集濾液于樣品瓶中，待分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Metrosep A Supp 5陰離子色譜柱(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：純水(A)和200 mmol/L碳酸氫銨溶液(含0.1%氨水)(B)；流速為0.6 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.0 min，10%～40% B；1.0～4.0 min，40%～80% B；4.0～5.0 min，80%～82.5% B；5.0～6.0 min，82.5%～95% B；6.0～7.0 min，95% B；7.0～7.1 min，95%～10%B；7.1～10.0 min，10% B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離負(fù)離子模式(ESI-)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度為600 ℃；噴霧電壓為- 4 500 V；霧化氣(GS1)為55 psi(379.223 kPa)，氣簾氣(CUR)為35 psi(242.325 kPa)；輔助氣(GS2)為45 psi(310.275 kPa)；碰撞氣(CAD)為High。所有分析物的保留時(shí)間、定量與定性離子對(duì)、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)見(jiàn)表1。

表1 8種極性農(nóng)藥的質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters of 8 polar pesticides

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下，先用針泵進(jìn)樣分析各目標(biāo)化合物的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用一級(jí)全掃描確定母離子;再采用Product Ion Scan，設(shè)定碰撞能量初始值為5 eV，以5 eV為步長(zhǎng)自動(dòng)調(diào)節(jié)碰撞能量，得到2個(gè)響應(yīng)值高的特征子離子。進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終確定8種極性農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測(cè)條件見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

草甘膦和草銨膦屬于強(qiáng)極性農(nóng)藥，在常規(guī)反相色譜柱上保留較弱。實(shí)驗(yàn)比較了3種適用于強(qiáng)極性化合物的色譜柱，分別為Metrosep A Supp 5陰離子色譜柱(150 mm×4.0 mm，5 μm)、Acclaim Trinity Q1(100 mm×3.0 mm，3 μm)和Torus DEA(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Metrosep A Supp 5陰離子色譜柱對(duì)8種極性農(nóng)藥的保留時(shí)間適宜，色譜峰形良好。

在Metrosep A Supp 5陰離子色譜柱上，以純水為流動(dòng)相A,比較了不同碳酸氫銨濃度(50、100、200、250 mmol/L)和氨水含量(0.01%、0.05%、0.1%和0.2%)的流動(dòng)相體系對(duì)8種極性農(nóng)藥色譜行為的影響。結(jié)果表明，以200 mmol/L碳酸氫銨和0.1%氨水作為流動(dòng)相B時(shí)，8種極性農(nóng)藥的色譜峰形良好，質(zhì)譜響應(yīng)值高，保留時(shí)間重現(xiàn)性好。綜上，本文選擇以Metrosep A Supp 5為色譜柱，200 mmol/L碳酸氫銨溶液(含0.1%氨水)和純水為流動(dòng)相體系，得到8種極性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖(TIC)及MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 8種極性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖及MRM色譜圖(5 ng/mL)Fig.1 Total ion and MRM chromatograms of 8 polar pesticides standard solutions(5 ng/mL)

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為保證檢測(cè)結(jié)果的時(shí)效性，對(duì)血液和尿液等生物體液的前處理多采用有機(jī)溶劑蛋白沉淀法。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈的蛋白沉淀效果，結(jié)果表明，當(dāng)樣品直接使用有機(jī)溶劑進(jìn)行蛋白沉淀時(shí)，8種極性農(nóng)藥的回收率均偏低。這是由于目標(biāo)物的極性較強(qiáng)，樣品粘稠，當(dāng)有機(jī)溶劑比例較高時(shí)，影響了目標(biāo)物的提取效果，因此在蛋白沉淀前先加入純水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。稀釋后的樣品，用乙腈的蛋白沉淀效果明顯優(yōu)于甲醇，故本文選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。

血液樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，冷凍高速離心后，上清液會(huì)變渾濁，可能是低溫下脂類(lèi)雜質(zhì)在溶劑中析出所致。PEP Plus固相萃取柱對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)有很好的吸附效果，且無(wú)需活化，操作簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上清液通過(guò)該柱后變?yōu)槌吻逋该鞯臓顟B(tài)。優(yōu)化的前處理?xiàng)l件如“1.3”所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

取0.2 mL血液或尿液樣品，按照“1.3”步驟進(jìn)行提取，取上清液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液，選擇10、100 ng/mL 2個(gè)濃度水平采用本方法進(jìn)行測(cè)定，并與“1.2”相應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積作比[16]。得出所有目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為86.5%～106%(見(jiàn)表2)，表明空白血液和尿液基質(zhì)對(duì)8種農(nóng)藥的檢測(cè)影響較小，本方法可用于血液、尿液中8種農(nóng)藥的定量檢測(cè)。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限與定量下限

使用空白血液樣品的凈化液，分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣檢測(cè)。以8種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)，所得峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。并以信噪比S/N≥3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)，S/N≥10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，8種目標(biāo)物在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r2>0.99)，LOD為0.08～0.3 ng/mL，LOQ為0.3～1 ng/mL(見(jiàn)表2)。

表2 8種極性農(nóng)藥的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量下限Table 2 Regression equations,correlation coefficients(r2),matrix effects,limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) for 8 polar pesticides

2.6 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取0.2 mL樣品，加入適量8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其樣品中質(zhì)量濃度為100 ng/mL。按照“1.3”步驟進(jìn)行提取,每個(gè)濃度平行6份，每日早、中、晚分別測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定6 d。分別求得血液、尿液樣品的平均回收率以及日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，血液和尿液中8種極性農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為81.5%～114%，RSD為1.1%～5.0%；日內(nèi)及日間RSD分別為0.30%～2.8%和0.50%～5.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，滿(mǎn)足法庭科學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 8種極性農(nóng)藥的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率(n=6)Table 3 Relative standard deviations(RSD) and recoveries of 8 polar pesticides(n=6)

2.7 實(shí)際案例應(yīng)用

2020年8月，吉林省某女子因家庭矛盾將其丈夫殺害，歸案后供述曾購(gòu)買(mǎi)除草劑服用，企圖自殺。除草劑名稱(chēng)為“草*膦”，辦案單位提取了該女子的血液送檢。取0.2 mL血液，按照本方法進(jìn)行分析，結(jié)果檢出了草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸、N-乙酰草甘膦和N-甲基草甘膦，其色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，本研究建立的方法可用于實(shí)際案例的檢驗(yàn)。

圖2 血液中檢出的草甘膦及其代謝物色譜圖Fig.2 Chromatograms of glyphosate and its metabolites in blood sample

3 結(jié) 論

本研究建立了血液和尿液中草甘膦、草銨膦等8種極性農(nóng)藥的非衍生化HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。與衍生化方法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，克服了以往LC-MS/MS檢測(cè)草甘膦、草銨膦穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體液中草甘膦、草銨膦等8種極性農(nóng)藥的定性定量分析，滿(mǎn)足草甘膦、草銨膦涉毒案(事)件的檢驗(yàn)鑒定要求。