俞 婷，周寶梅，徐 敏，耿玉闖，劉洪林

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

食源性致病菌(比如沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等)引起的疾病是全世界最重要的公共安全問題之一，也是全球食源性疾病高發(fā)病率和死亡率的重要因素。2015年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球食源性疾病負(fù)擔(dān)估算報(bào)告[1]顯示：2010年，全球發(fā)生約6億起食源性疾病，其中以非傷寒腸道沙門氏菌為主的病原體造成約23萬人死亡，而實(shí)際發(fā)生的疾病數(shù)量可能是報(bào)告數(shù)量的300～350倍。此外，有研究對(duì)食源性致病菌引起的疾病發(fā)病率進(jìn)行估計(jì)[2]，認(rèn)為我國(guó)每年約有1億人患細(xì)菌性食源性疾病，然而由于報(bào)告體系不健全，監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告的發(fā)病人數(shù)遠(yuǎn)少于此數(shù)據(jù)。從以上現(xiàn)狀來看，迫切需要一種高效、快速的致病菌檢測(cè)技術(shù)用于現(xiàn)場(chǎng)或臨床檢測(cè)，以達(dá)到預(yù)防、控制食源性疾病，完善食源性疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的目的。

細(xì)菌培養(yǎng)法是一種常用的致病菌檢測(cè)方法，樣品中的致病菌經(jīng)過幾天的增菌、分離培養(yǎng)后，可根據(jù)菌落特征、生化試驗(yàn)或血清學(xué)鑒別判定致病菌種類，通過平板計(jì)數(shù)法對(duì)致病菌進(jìn)行定量。但這種方法步驟復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)，在等待培養(yǎng)結(jié)果時(shí)，不能明確病菌類別，通常使用廣譜抗生素對(duì)患者進(jìn)行非針對(duì)性的過度治療，限制了緊急情況下食源性疾病的診斷和控制。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3-4]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[5]等技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。然而，這些技術(shù)仍存在假陰性、假陽性、步驟復(fù)雜、檢測(cè)成本高等問題，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)或臨床診斷上的廣泛應(yīng)用。因此，為了公共安全和人類健康、減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，亟需發(fā)展一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的致病菌檢測(cè)方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術(shù)具有靈敏度高、熒光背景低、前處理簡(jiǎn)單、快速無損等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)與生物傳感等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，目前已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品中農(nóng)藥殘留、非法添加物、毒素等[6-9]，在致病菌種類和耐藥性檢測(cè)方面也表現(xiàn)出應(yīng)用潛力，有望發(fā)展成一種被廣泛接受的檢測(cè)技術(shù)。本文綜述了近5年來利用基于標(biāo)簽和無標(biāo)簽SERS技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的研究進(jìn)展，介紹了常用的SERS活性納米結(jié)構(gòu)，討論了SERS在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用；最后，對(duì)該技術(shù)目前存在的問題及今后的研究趨勢(shì)進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 SERS簡(jiǎn)介

SERS是一種高靈敏的無損快檢技術(shù)，當(dāng)分子吸附到特定金屬表面(如金或銀納米粒子)時(shí)，其非彈性光散射被極大增強(qiáng)。1974年，F(xiàn)leischmann等[10]第一次觀察到SERS現(xiàn)象，他們將吡啶吸附到粗糙銀電極上時(shí)意外發(fā)現(xiàn)吡啶分子的拉曼信號(hào)增強(qiáng)，并把此現(xiàn)象歸因于表面積增加導(dǎo)致吸附的吡啶分子數(shù)量增加而使信號(hào)增強(qiáng)。1977年，Jeanmaire等[11]及Albrecht等[12]均確認(rèn)這一增強(qiáng)現(xiàn)象達(dá)105～106倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出分子吸附數(shù)量增加所能引起的信號(hào)增強(qiáng)，并提出由于電極表面效應(yīng)增加了分子拉曼散射截面的觀點(diǎn)。隨后，Moskovits[13]提出這種增強(qiáng)由粗糙金屬表面?zhèn)鲗?dǎo)電子集體共振引起。經(jīng)過四十多年的發(fā)展，已有大量論文對(duì)SERS機(jī)理、增強(qiáng)基底的設(shè)計(jì)及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行研究。這些研究使拉曼技術(shù)獲得突破性進(jìn)展，為克服普通拉曼散射弱的缺點(diǎn)提供了方法。

目前，電磁增強(qiáng)(EM)和化學(xué)增強(qiáng)(CE)是被廣泛認(rèn)同的兩種增強(qiáng)機(jī)理。電磁增強(qiáng)是指當(dāng)入射光與金屬結(jié)構(gòu)作用時(shí)，電磁波可以引起金屬表面局域等離子體共振(LSPR)，使金屬表面的局部電磁場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，這是SERS增強(qiáng)的關(guān)鍵。當(dāng)待測(cè)分子靠近等離子體材料附近時(shí)，分子拉曼信號(hào)會(huì)顯著增強(qiáng)，產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼光譜，且SERS強(qiáng)度隨著距離減小而逐漸增強(qiáng)。此外，當(dāng)兩個(gè)納米顆粒足夠接近時(shí)，它們可以在間隙中產(chǎn)生極大的SERS增強(qiáng)，這種空間局域化區(qū)域被稱為“熱點(diǎn)”，其增強(qiáng)因子最高可達(dá)1011，如此高的增強(qiáng)有利于檢測(cè)各種共振和非共振分子[14-15]?；瘜W(xué)增強(qiáng)是指被吸附在金屬表面的分子中的電子與金屬表面電子相互作用產(chǎn)生的增強(qiáng)，雖然化學(xué)增強(qiáng)的增強(qiáng)因子只有10～100倍，但其與電磁增強(qiáng)的協(xié)同關(guān)系，可以顯著改善SERS的增強(qiáng)特性[16]。在食源性致病菌檢測(cè)中，“熱點(diǎn)”效應(yīng)發(fā)揮了主要作用：金屬納米材料通過靜電吸附或識(shí)別配體作用結(jié)合到致病菌表面，納米材料之間形成豐富的“熱點(diǎn)”，使致病菌表面分子或拉曼標(biāo)簽信號(hào)極大地增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)致病菌的靈敏直接或間接SERS檢測(cè)。

2 SERS活性納米結(jié)構(gòu)

為達(dá)到理想的致病菌檢測(cè)效果，研究人員致力于制備高靈敏、穩(wěn)定、可重復(fù)、選擇性好的SERS基底，大致可分為3類：

(1)納米溶膠及其組裝：金、銀納米溶膠是廣泛使用的SERS基底，成本低、制備方便且SERS性能優(yōu)異，金納米顆粒形貌規(guī)則、尺寸均勻，銀顆粒的SERS活性更強(qiáng)但不太穩(wěn)定，金銀核殼結(jié)構(gòu)顆粒則兼顧了兩者的優(yōu)點(diǎn)[17-18]；為進(jìn)一步優(yōu)化SERS增強(qiáng)效果，研究人員制備了形態(tài)各異的納米結(jié)構(gòu)，如金納米線囊泡[19]、刺狀金顆粒[20]等，它們具有豐富的尖端，能提供更強(qiáng)的電磁增強(qiáng)。Zhou等[21]合成了骨頭形狀的金納米棒(圖1A)，其頂點(diǎn)具有更多熱點(diǎn)，拉曼信號(hào)強(qiáng)度比普通金棒增強(qiáng)118倍；基于納米骨的SERS傳感器用于檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，檢測(cè)限可低至3 CFU/mL。此外，相比于溶膠中納米顆粒的隨機(jī)聚集，可控聚集形成的“熱點(diǎn)”，如納米顆粒的二聚組裝[22-23]、核-衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)[24]等，既能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度又可保證檢測(cè)的重現(xiàn)性，已引起研究人員的廣泛興趣。Wu等[23]利用帶兩個(gè)巰基的金屬絡(luò)合物合成金顆粒二聚體并修飾志賀氏菌的特異性適配體，對(duì)食品中的志賀氏菌檢測(cè)表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏度，檢測(cè)限為10 CFU/mL。

(2)固氣界面納米結(jié)構(gòu)：溶膠類SERS基底易受環(huán)境因素影響，儲(chǔ)存穩(wěn)定性相對(duì)較差，因此，有研究通過物理吸附、化學(xué)吸附或毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)等手段將納米材料固定于玻片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜、濾紙[25-27]等固體襯底上來提高基底的穩(wěn)定性和便攜性。Qiu等[28]通過在硅片上控制納米棒溶膠的緩慢蒸發(fā)，制得垂直的納米棒陣列(圖1B)，可提供大規(guī)模均勻、高靈敏的SERS基底，實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌、木糖葡萄球菌、屎腸球菌的無標(biāo)簽檢測(cè)及區(qū)分。此外，還有研究通過電子束光刻法或壓印法制備形狀、大小、間隙可控的納米圖案[29-30]，鍍上金膜后得到穩(wěn)定性、均一性較好的基底。

(3)液相界面等離子體陣列：液相界面組裝的納米顆粒陣列具有可調(diào)諧、可重復(fù)、多相可及性等優(yōu)點(diǎn)，是SERS技術(shù)實(shí)用化的突破方向之一。本課題組在水/油界面上構(gòu)筑了具有界面自愈合、形狀自適應(yīng)的三維納米陣列(圖1C)，通過改變?nèi)萜鞯谋砻娼?rùn)性實(shí)現(xiàn)了三維陣列對(duì)水、油兩相的可逆包覆[31]；調(diào)節(jié)界面的納米顆粒密度可優(yōu)化SERS增強(qiáng)效果[32]。此外，我們提出了利用有機(jī)溶劑作為內(nèi)標(biāo)校正光譜信號(hào)的策略，實(shí)現(xiàn)了兩相中不同溶解度分子的可靠、定量檢測(cè)[33]。這種液相等離子體陣列已被成功用于食品中農(nóng)藥殘留、油脂氧化、食用油中多環(huán)芳烴等[33-35]的檢測(cè)。目前食源性致病菌檢測(cè)中的基底主要為前兩類，本課題組正在開展利用液相界面等離子體陣列檢測(cè)致病菌的研究。

3 SERS在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 無標(biāo)簽的直接檢測(cè)

無標(biāo)簽SERS檢測(cè)，也稱直接檢測(cè)，該法通過將SERS基底直接與致病菌懸浮液進(jìn)行孵育，使致病菌靠近基底表面，增強(qiáng)致病菌拉曼信號(hào)并獲得其固有指紋信息，具有操作簡(jiǎn)便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。由于致病菌生物組成復(fù)雜且光譜信息豐富，大多數(shù)生物分子拉曼散射截面相對(duì)較小，實(shí)際樣品中雜質(zhì)較多等客觀因素的存在，無標(biāo)記檢測(cè)的研究主要致力于3個(gè)方面：(1)從復(fù)雜樣品中分離致病菌，減少其他成分對(duì)致病菌SERS光譜的干擾；(2)制備靈敏度高、重現(xiàn)性好的SERS基底，提高無標(biāo)簽檢測(cè)能力；(3)解析致病菌的SERS光譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法和機(jī)器學(xué)習(xí)算法提取光譜中有效信息，達(dá)到鑒別、分類等目的。

目前已有很多研究利用不同納米結(jié)構(gòu)測(cè)量純培養(yǎng)致病菌的SERS光譜，并嘗試對(duì)其特征峰歸屬進(jìn)行分配。致病菌的SERS光譜主要來源于細(xì)胞壁的成分，包括肽聚糖、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸等。一些常見的峰如649、730、958、1 030、1 241、1 325、1 457、1 580 cm-1等(歸屬見表1)，在不同致病菌SERS光譜中普遍存在，但由于分子含量、分布不同等原因，相對(duì)強(qiáng)度存在差異。如革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量比革蘭氏陽性菌少，因此革蘭氏陰性菌SERS光譜中來源于肽聚糖糖苷環(huán)振動(dòng)模式的730 cm-1處的峰強(qiáng)比革蘭氏陽性菌弱[36]。由于致病菌在分子水平上組成復(fù)雜，盡管已經(jīng)對(duì)一些特征峰來源進(jìn)行解釋，但不同研究人員給出的歸屬并不相同，不利于統(tǒng)一分析，目前仍缺乏一個(gè)完整的SERS光譜峰分配數(shù)據(jù)庫。

表1 致病菌SERS光譜的拉曼位移和歸屬分配[36-40]Table 1 Raman shift and tentative band assignment of the SERS spectra of pathogen[36-40]

細(xì)胞壁成分差異會(huì)引起SERS光譜差異，使得不同屬、不同種、同種但不同來源的菌株及耐藥菌株的分類判別成為可能。然而致病菌SERS光譜指紋信息豐富，一般難以通過直接觀察判別不同致病菌(圖2A)，因此，大多數(shù)研究通常借助多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行“降維”，提取光譜中有效信息，建立分類模型。常見的方法有主成分分析(PCA)[41-42]、線性判別分析(LDA)、分層聚類分析(HCA)[43]、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)[44]。Liu等[45]利用帶正電荷的金納米棒作為增強(qiáng)基底，分別采集了4種假單胞菌的SERS光譜，利用PCA和LDA實(shí)現(xiàn)了不同種假單胞菌的分類；利用HCA得到的聚類結(jié)果與16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹一致。Witkowska 等[40]在粗糙銀盤表面沉積金顆粒作為SERS基底，結(jié)合PCA實(shí)現(xiàn)了基因組不同的單增李斯特菌菌株及基因組相同但引入了不同抗性基因的菌株的區(qū)分。對(duì)于組間差異不夠明顯的樣品或信噪較低的光譜數(shù)據(jù)集，有研究利用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[46-47]、遺傳算法(GA)[27]或卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CNN)[48](圖2B)濾除與分類信息無關(guān)的噪音，提取特征信息，提高模型的判別能力和效果。

圖2 來自30個(gè)菌株的2 000條光譜的平均值(粗體)(A)和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)示意圖(B)[48]Fig.2 Averages of 2 000 spectra from 30 isolates(in bold)(A)and schematic illustration of convolutional neural network(B)[48]

減少實(shí)際樣品中雜質(zhì)干擾、獲得可靠的致病菌指紋圖譜是進(jìn)行后續(xù)光譜分析與處理的前提。近年來，對(duì)實(shí)際樣品中致病菌進(jìn)行直接檢測(cè)的研究相對(duì)較少，主要分為兩類：(1)將納米材料固定在硅片上，滴加樣品溶液進(jìn)行孵育后用超純水沖洗除去雜質(zhì)[49]；(2)利用磁性納米顆粒從樣品中分離致病菌，加入納米顆粒采集致病菌SERS光譜[50]。捕獲機(jī)制主要是帶正電納米材料與帶負(fù)電致病菌之間的靜電吸附作用及4-巰基苯硼酸(4-MPBA)、萬古霉素與細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的共價(jià)或氫鍵結(jié)合。其中，4-MPBA的特征峰會(huì)掩蓋致病菌的部分特征峰[51]，雖然不影響不同種致病菌的分類判別，但可能不利于差異不大的菌種判別。利用固氣界面進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，近場(chǎng)等離子效應(yīng)只能影響細(xì)菌與基底接觸的界面，這意味著只有界面附近的拉曼信號(hào)可以增強(qiáng)。因此，Ge等[26]用修飾萬古霉素的銀包金納米棒陣列捕獲大腸桿菌、沙門氏菌或木糖葡萄球菌后，進(jìn)一步將銀納米片沉積到細(xì)菌間隙中，盡可能獲得完整的細(xì)菌指紋信息；納米片和納米陣列之間的協(xié)同增強(qiáng)提高了直接檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)1 000 CFU/mL。Wang等[52]利用磁性納米顆粒捕獲致病菌后，再加入銀包金納米顆粒覆蓋致病菌未被占據(jù)的表面，填補(bǔ)磁性顆粒與致病菌間的間隙，提供大量熱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的高靈敏檢測(cè)。盡管目前研究通過直接檢測(cè)獲得了較低的檢測(cè)限，但在致病菌濃度較低時(shí)，僅出現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)特征峰，雖可實(shí)現(xiàn)致病菌檢出，但可能不利于利用算法進(jìn)行分類判別。

3.2 基于拉曼標(biāo)簽的間接檢測(cè)

無標(biāo)簽檢測(cè)所需致病菌濃度普遍較高，得到的光譜復(fù)雜且難以分析，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)和定量分析仍有一定難度，因此，目前對(duì)致病菌進(jìn)行高靈敏的定性定量檢測(cè)主要依賴基于標(biāo)簽的SERS檢測(cè)方法，檢測(cè)限低至幾至幾十CFU/mL。一般來說，檢測(cè)時(shí)首先用識(shí)別配體功能化的納米顆粒(捕獲探針)從樣品中捕獲致病菌，然后加入修飾識(shí)別配體和報(bào)告分子的納米顆粒(信號(hào)探針)形成“三明治”復(fù)合物，產(chǎn)生熱點(diǎn)及增強(qiáng)的SERS信號(hào)；識(shí)別配體用于特異性捕獲靶標(biāo)致病菌，而報(bào)告分子的信號(hào)強(qiáng)度反映該致病菌的含量。常見的報(bào)告分子有4-巰基苯甲酸(4-MBA)、4-巰基吡啶(4-MPY)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等，報(bào)告分子有較大的拉曼散射截面和較窄的特征峰，有利于同時(shí)檢測(cè)多種致病菌；也有少數(shù)報(bào)道將用于納米顆粒功能化的蛋白[53]、DNA[54]作為報(bào)告分子。常見的識(shí)別配體有抗體和核酸適配體。目前，抗體已被廣泛用于各種免疫檢測(cè)試驗(yàn)中，其制備技術(shù)成熟，但價(jià)格昂貴、修飾困難；適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列，與抗體相比，具有合成簡(jiǎn)單、成本低、易于修飾、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)；但目前通過篩選得到的適配體較少，只能用于少數(shù)菌的檢測(cè)。隨著指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)的不斷進(jìn)步，將來適配體可能成為抗體的潛在替代品。此外，萬古霉素[55]、3-巰基苯硼酸[56-57]等小分子價(jià)格低廉，能與細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖結(jié)合，可作為廣譜識(shí)別配體與特異性抗體、適配體一起使用，不僅能降低檢測(cè)成本，還不影響檢測(cè)效果。

檢測(cè)時(shí)為除去樣品雜質(zhì)及未結(jié)合的信號(hào)探針，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，有研究將復(fù)合物離心洗滌2～3次后采集SERS光譜[58]，但加入離心步驟增加了檢測(cè)時(shí)間和程序，并在一定程度上影響探針的穩(wěn)定性。近年來，磁性納米粒子因便于分離被越來越多地應(yīng)用于致病菌的SERS檢測(cè)[59-61]。Li等[62]利用適配體功能化的磁性納米顆粒作為捕獲探針，通過施加外部磁場(chǎng)從實(shí)際樣品中分離、濃縮大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，結(jié)合修飾適配體和報(bào)告分子的SERS標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了樣品中兩種細(xì)菌的同時(shí)靈敏檢測(cè)(圖3A)。此外，在磁性納米顆粒表面覆蓋一層貴金屬外殼制備的磁性等離子體顆粒(MPP)，同時(shí)具有磁性響應(yīng)和SERS性能，在SERS傳感領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景[63]。MPP的合成方法主要有兩種：(1)磁性納米顆粒表面修飾氨基后直接吸附已合成的貴金屬納米顆粒，但納米顆粒通常分布不均勻[64]；(2)利用化學(xué)結(jié)合或靜電吸附將金種子結(jié)合在磁性顆粒表面，通過種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法在磁性顆粒周圍形成連續(xù)而均勻的外殼[63,65](圖3B)。You等[53]合成了殼聚糖包被的淀粉磁珠，在其表面原位合成AuNPs形成致密包裹的外層并進(jìn)行抗體功能化，利用這種磁珠捕獲、分離、濃縮樣品中大腸桿菌O157∶H7，可以檢測(cè)到單個(gè)大腸桿菌的信號(hào)，為食品中致病菌的檢測(cè)提供了一種高靈敏、強(qiáng)有力的手段。此外，也有研究將捕獲探針固定在固體支撐材料上，用超純水或緩沖液沖洗即可除去雜質(zhì)及未結(jié)合探針，無需離心及重懸等復(fù)雜步驟[25]。

圖3 磁性顆粒捕獲致病菌用于檢測(cè)的示意圖[62](A)與(B)種子生長(zhǎng)法合成磁性等離子體顆粒示意圖[63]Fig.3 Schematic illustration of magnetic particle capture for detection of pathogen[62](A)and synthesis of magnetic plasma particles by seed growth method [63](B)

基于標(biāo)簽的SERS檢測(cè)方法已證明可以對(duì)致病菌進(jìn)行高靈敏檢測(cè)(表2)，但仍存在一些問題需要改進(jìn)：SERS探針制備過程相對(duì)復(fù)雜且耗時(shí)久，不能長(zhǎng)時(shí)間存放；檢測(cè)時(shí)探針與致病菌孵育時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要1～2 h；識(shí)別配體的靶標(biāo)分子在致病菌表面分布不均，導(dǎo)致探針分布不均，可能影響信號(hào)重現(xiàn)性。因此，仍需探索快速、簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好的間接檢測(cè)方法。

表2 間接檢測(cè)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Application of indirect methods in the detection of foodborne pathogens

3.3 與其他技術(shù)結(jié)合的研究

當(dāng)前，結(jié)合新型樣品分離和光譜解析等技術(shù)方法，發(fā)揮SERS檢測(cè)手段的優(yōu)勢(shì)，開展致病菌檢測(cè)研究是一個(gè)重要趨勢(shì)。側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)(LFA)是一種免疫層析技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，在即時(shí)檢測(cè)(POCT)中受到廣泛關(guān)注，但存在靈敏度低、定量分析有限的缺點(diǎn)。為了解決這些問題，有報(bào)道開發(fā)了基于SERS的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)方法[67，71-74]。He等[73]合成的鉑包覆的金納米棒(AuNPs@Pt)具有較強(qiáng)的電磁場(chǎng)強(qiáng)度和較好的穩(wěn)定性。當(dāng)樣品溶液被滴加到樣品墊上并在毛細(xì)作用力下流動(dòng)到結(jié)合區(qū)，空腸彎曲桿菌將與4-MBA、抗體功能化的AuNPs@Pt特異性結(jié)合，復(fù)合物繼續(xù)流過硝酸纖維素膜至信號(hào)線被二抗捕獲。在785 nm激光激發(fā)下，采集4-MBA的SERS光譜，信號(hào)強(qiáng)度與空腸彎曲桿菌濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為50 CFU/mL。此方法結(jié)合了LFA和SERS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，具有很大的商業(yè)應(yīng)用潛力。

基于SERS的微流控平臺(tái)具有便攜、樣品體積小、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)[75]，并能提供一個(gè)較穩(wěn)定的工作環(huán)境以改善SERS檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性[76]，近年來引起了研究人員的極大興趣。此外，微流控平臺(tái)可將樣品預(yù)處理、富集、靶標(biāo)分選、檢測(cè)等多個(gè)步驟集成到一塊芯片上，自動(dòng)化程度高，簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序。在致病菌檢測(cè)應(yīng)用中，SERS與微流控技術(shù)的結(jié)合操作簡(jiǎn)單、速度快、儀器小，在快速即時(shí)分析方面具有很高的潛力且可以檢測(cè)到極低水平的致病菌[77]，有望成為實(shí)際應(yīng)用的突破方向之一。

近年來，以卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CNN)為代表的深度學(xué)習(xí)算法成為光譜分析、模型建立的一個(gè)新研究熱點(diǎn)。CNN受動(dòng)物視覺皮層中神經(jīng)元復(fù)雜連接模式的啟發(fā)，通常由卷積層、池化層、全聯(lián)層組成，這些不同功能的層組成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，逐步提取光譜數(shù)據(jù)中的特征并進(jìn)行分類，在信噪比較低的光譜數(shù)據(jù)處理方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)[78]。Ho等[48]將CNN應(yīng)用于光譜采集時(shí)間為1 s、信噪比為4.1的30種常見臨床分離株單細(xì)胞SERS光譜分析，獲得了比常見分類方法更高的準(zhǔn)確性，并能減少光譜預(yù)處理及變量選取步驟，為提高致病菌無標(biāo)記檢測(cè)靈敏度提供了方向。隨著深度學(xué)習(xí)算法的不斷優(yōu)化，結(jié)合算法的SERS技術(shù)有望向更準(zhǔn)確、廣泛的方向發(fā)展。

4 總結(jié)與展望

SERS作為一種靈敏度高、快速、無損的新興檢測(cè)技術(shù)，在食源性致病菌檢測(cè)方面已表現(xiàn)出很大的應(yīng)用潛力與前景，但要發(fā)展成為一種廣泛使用的快檢技術(shù)，還存在一些問題和改進(jìn)空間。對(duì)于直接檢測(cè)而言，(1)制備超靈敏、重現(xiàn)性好的SERS基底仍是檢測(cè)的關(guān)鍵；大多數(shù)研究中SERS基底與致病菌表面接觸有限，采集的SERS光譜未能全面地反映致病菌指紋信息；(2)不同SERS基底、樣品前處理手段、光譜采集參數(shù)及預(yù)處理方法都會(huì)影響SERS的背景、峰強(qiáng)度、峰位置，因此SERS方法標(biāo)準(zhǔn)化是用于實(shí)際檢測(cè)的前提；(3)目前的直接檢測(cè)研究均基于不同的技術(shù)和參數(shù)，得到的SERS光譜難以進(jìn)行統(tǒng)一分析和利用。在SERS方法標(biāo)準(zhǔn)化后，應(yīng)建立一個(gè)食源性致病菌光譜數(shù)據(jù)庫，全面收集不同種類致病菌、不同生長(zhǎng)階段、承受不同環(huán)境壓力時(shí)的SERS光譜以及混合菌的混合光譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和比較，為致病菌檢測(cè)提供更可靠的工具。

對(duì)間接檢測(cè)而言，大多數(shù)方法已能滿足金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的檢測(cè)需求，但檢測(cè)某些限量要求嚴(yán)格[79]的致病菌(如沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7等)時(shí)，還需開發(fā)低至單個(gè)致病菌檢測(cè)限的SERS基底。此外，實(shí)際檢測(cè)時(shí)樣品中非致病菌組分可能干擾檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的樣品前處理手段或選擇性好的SERS基底仍是實(shí)際應(yīng)用的前提。當(dāng)前，雖然SERS技術(shù)尚未應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)，但隨著SERS基底的不斷優(yōu)化、各種便攜式和手持式拉曼光譜儀的出現(xiàn)以及與其他技術(shù)聯(lián)用的發(fā)展，SERS有望成為一種可靠的常規(guī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，幫助預(yù)防和控制食源性疾病。