段超杰，王浩臻，高兵(★通信作者)

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110136）

0 引言

癌癥是20 世紀最可怕的疾病之一。隨著21 世紀癌癥發(fā)病率的不斷增加而進一步蔓延，這種情況非常令人擔憂。癌癥是一種代謝性疾病[1]，癌細胞與正常細胞相比，主要生化特征之一是即使在低氧條件下也會發(fā)生從氧化磷酸化到糖酵解增加的代謝轉換，這被稱為Warburg 效應[2]。這種對糖酵解的依賴性也使腫瘤缺氧區(qū)的細胞具有生長優(yōu)勢。癌癥代謝中糖酵解異常增加很大程度上取決于失調的代謝酶。大量研究表明，LDHA 與乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞癌、口腔鱗狀上皮癌、前列腺癌等癌癥密切相關[3-9]。LDHA 是在腫瘤細胞的代謝中起關鍵作用的酶[10-14]，通過將丙酮酸轉化為乳酸來促進糖酵解過程,在許多類型的癌癥中表達升高，并于腫瘤的生長，維持和侵襲有關[2]。LDHA 的抑制作用會切斷癌癥的能量和合成代謝效應，從而降低癌細胞的轉移和侵襲潛能[15]。因此該酶被認為是新的抗癌藥物的潛在靶標。

LDHA 是乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)家族中的一員，是由LDH-A 基因編碼的M 亞基組成的四聚體酶，并要與NADH 結合后才可發(fā)揮生物學活性。NADH 依賴酶LDHA 介導了當胞漿NADH/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 比率較高時，催化丙酮酸還原為乳酸的氧化還原反應，這是再生NAD+的關鍵步驟，并且需要維持糖酵解以延續(xù)癌細胞的存活[16-18]。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些MicroRNA可通過直接與其3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結合來抑制LDHA mRNA 表達水平，從而阻礙糖酵解，細胞增殖和侵襲[6,19,20]。除此之外，一些天然化合物被報道對LDHA 活性也存在抑制作用，包括Stiripentol[21]，Machilin A[22]，天然產(chǎn)物棉酚[23]，N-羥基吲哚[15]，衍生物FX-11[24]，它們其中大部分都是通過阻斷LDHA 的NADH 結合位點而成為競爭性抑制劑，可抑制各種癌細胞中的LDHA 活性。

計算機虛擬篩選(Virtual Screening)是藥物開發(fā)的重要手段之一,被廣泛應用于現(xiàn)代藥物前期開發(fā)。其中分子對接(Molecular Docking)是在經(jīng)過綜合計算后，預測受體分子和配體分子間的結合方式和結合能力。虛擬篩選依賴有效的藥物靶點和豐富的化合物數(shù)據(jù)庫。在藥物開發(fā)過程中虛擬篩選使用的化合物通常是盡可能涵蓋所有可及的化合物，但該研究的主要目的是尋找具有潛在醫(yī)療價值的天然產(chǎn)物，所以將只使用天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫。Drug Bank數(shù)據(jù)庫是一個獨特的生物信息學和化學信息學資源庫，它將詳細的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶點信息結合到一起，為我們提供了豐富的天然產(chǎn)物的資源。

本研究旨在以LDHA 的NADH 結合區(qū)為靶點，運用計算機虛擬篩選技術，篩選出一批有效的天然產(chǎn)物，為癌癥救治提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛋白質晶體結構來自PDB 數(shù)據(jù)庫(RCSB Protein Date Bank)；天然產(chǎn)物結構來自Drug Bank 數(shù)據(jù)庫；Auto Dock Tools，Auto Dock Vina 分子對接軟件，PyMol 分子三維結構顯示軟件，深度學習GPU 靜音服務器。

1.2 靶蛋白處理

在蛋白質數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站RCSB 下載人類LDHA 酶的三維結構數(shù)據(jù)，PDB ID:1I10。用PyMol 與Auto Dock Tools 進行處理，除去多余的分子，將其格式轉換為Pdbqt 格式。最后以NADH 結合區(qū)作為對接口袋，利用Grid box 程序生成對接口袋格點文件。

1.3 小分子配體庫的建立

所有化合物的三維結構從Drug Bank 數(shù)據(jù)庫進行下載，共計7877 種。

1.4 小分子配體庫與受體蛋白的分子對接

將獲取到的所有文件都存放在深度學習GPU 靜音服務器中。以小分子配體為分子探針，根據(jù)生成的對接口袋格點文件對處理后的LDHA 受體進行Auto Dock Vina 虛擬篩選。根據(jù)對接結果給出的結合能由小到大排序，提取并過濾出活性最佳的化合物。NADH 是LDHA 酶的輔因子，兩者結合后才可發(fā)揮生物學活性。選擇NADH 與LDHA 的結合位點作為對接口袋進行虛擬篩選。對接口袋設置為：center(x,y,z)=(19.875,54.312,173.081)，size(x,y,z)=(30,24,22)。

2 結果

2.1 LDHA 晶體結構

LDHA 的三維晶體結構(PDB ID:1I10)從蛋白質數(shù)據(jù)庫(PDB)下載。用PyMol 去除多余的配體，再用Auto Dock Tools 刪除水分子，加電荷，加氫原子等處理，然后轉換為Pdbqt 格式。經(jīng)處理后的LDHA 的晶體結構見圖1。

圖1 LDHA 的晶體結構

2.2 天然產(chǎn)物的對接結果

經(jīng)過Auto Dock vina 首輪的虛擬篩選從7877個化合物中得到了74 個結合能小于-10.0 的化合物。之后，用Auto Dock 對接軟件在74 個化合物中復篩，得到最佳的5 個化合物（表1），包括2'-deoxy-N-(naphthalen-1-ylmethyl) guanosine 5'-(dihydrogen phosphate),MGB-BP-3,Naldemedine,RU85053,2-[4-[(Z)-2-Acetamido-3-oxo-3-[[(3S)-2-oxo-1-[(4-phenylphenyl)methyl]azepan-3-yl]amino]prop-1-enyl]-2-formylphenyl]acetic acid。并將這5 個化合物作進一步分析，化合物結構見圖2。

表1 候選小分子的打分值

2.3 中靶化合物與LDHA 的相互作用模型

針對中靶化合物進行了進一步的分析，得到了5 個化合物與LDHA 的相互作用模型，結果顯示5 個分子均準確地對接到LDHA 的NADH 結合區(qū)，并與周圍的等氨基酸形成相互作用，影響了NADH 與ALA29,VAL30,ASP51,ALA97 等氨基酸殘基的疏水作用以及與ARG98,ASN137,HIS192,THR247 等氨基酸殘基的氫鍵結合（圖3）。

圖2 候選化合物的結構

3 討論

LDHA 是機體內一個重要的脫氫酶，與NADH 結合后參與許多重要的生物學過程。在人體組織中有5種活性LDH 同工酶，每一種都是由M 和H 兩個主要亞基組成的四聚體酶，分別由LDH-A 和LDH-B 編碼。骨骼肌以M 亞單位為主，心肌以H 亞單位為主。當A鏈多于B 鏈時，LDH 同工酶在催化丙酮酸轉化為乳酸方面變得更為有效；相反，B 鏈的過量有利于丙酮酸進入檸檬酸循環(huán)轉化為乙酰輔酶A[2]。在正常生理條件下，丙酮酸由葡萄糖通過糖酵解生成，并在線粒體中進入檸檬酸循環(huán)形成乙酰輔酶A，用于促進氧化磷酸化。然而，當氧氣缺乏時，細胞無法利用氧化磷酸化有效地產(chǎn)生ATP。在這種情況下，糖酵解成為ATP 的主要來源。與正常細胞相比，癌細胞的糖酵解速率增加。LDHA 在調節(jié)糖酵解中起著關鍵的作用，它的上調有助于提高腫瘤細胞厭氧糖酵解的效率，降低它們對氧的依賴性，以產(chǎn)生足夠的能量來滿足快速增殖的腫瘤細胞的需求。因此，以LDHA 為靶點，設計研發(fā)特異性的LDHA 抑制劑可為癌癥的治療提供新的思路和潛在藥物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LDHA 抑制劑也在癲癇[25]，腎草酸鈣結石[26]等疾病的防治也具有重要作用。虛擬篩選技術是進行創(chuàng)新藥物研究的新技術，由于其高效、快速、經(jīng)濟等優(yōu)勢，近年來已經(jīng)成為一種與高通量篩選互補的藥物篩選技術。目前，虛擬篩選技術已經(jīng)用于LDHA 抑制劑的研發(fā)[27-29]。

本研究以LDHA 的NADH 結合區(qū)為靶點,利用Auto Dock Vina 對接軟件對Drug Bank 數(shù)據(jù)庫7877個化合物進行虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了5 個新的高活性LDHA 抑制劑。通過數(shù)據(jù)庫查詢我們發(fā)現(xiàn)中靶化合物MGB-BP-3 與Naldemedine 的藥理學信息。其中，MGB-BP-3正在進行治療艱難梭菌感染的臨床試驗當中。Naldemedine是一種類鴉片受體拮抗劑，可以拮抗阿片類藥物的便秘作用，于2017年在美國和日本被批準用于治療阿片類藥物引起的便秘。筆者的篩選結果可為新的LDHA抑制劑的研發(fā)提供有用的信息。隨著虛擬篩選工具的不斷改進，LDHA抑制劑的研發(fā)速度必定會大大提高。通過虛擬篩選設計小的類藥物分子來靶向LDHA是可以實現(xiàn)的，并且能夠阻礙腫瘤的生長和維持。然而，虛擬篩選技術僅僅是創(chuàng)新藥物研究的輔助性工具，僅僅考慮受體配體的相互作用，而未考慮藥物復雜的作用機制以及可能存在的毒性作用等問題，所以許多中靶化合物仍然需要進一步的發(fā)展來提高其特異性和效力。因此，本研究通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的5個高活性的LDHA抑制劑有待進一步通過實驗驗證其藥理活性及毒性。