呂正鑫，劉 青，廖光聯(lián)，2，黃春輝，賈東峰，徐小彪，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院∕獼猴桃研究所，江西南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西南昌 330045）

【研究意義】毛花獼猴桃（Actinidia erianthaBenth.）為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）雌雄異株的多年生藤本果樹(shù)，作為我國(guó)特有的獼猴桃種質(zhì)資源，在長(zhǎng)江以南200～1 000 m海拔處的山區(qū)廣泛分布[1]。目前世界獼猴桃的主栽品種比較單一，隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，消費(fèi)水平的升級(jí)，培育新的栽培品種具有重要意義[2]。毛花獼猴桃果實(shí)維生素C含量為中華獼猴桃的3～4倍[3]，且具有抗逆性強(qiáng)、富含礦物質(zhì)及風(fēng)味好、口感佳等優(yōu)點(diǎn)，有巨大的發(fā)展?jié)摿?，是潛在的?yōu)質(zhì)獼猴桃種質(zhì)資源選育的新品種[4]。雌雄異株現(xiàn)象在果樹(shù)作物中普遍存在，植株自身的經(jīng)濟(jì)價(jià)值往往因性別的差異而有很大不同。從形態(tài)學(xué)上看，獼猴桃科（Actinidiaceae）為功能性雌雄異株植物，目前生產(chǎn)上以雌株果實(shí)產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯高于雄株，雄株在生產(chǎn)上多作為授粉配對(duì)用樹(shù)，雖然雄花的花青苷含量較高、花色明艷、具有一定觀賞價(jià)值，但現(xiàn)階段毛花獼猴桃的育種工作仍集中在優(yōu)質(zhì)雌株的選育方面。獼猴桃實(shí)生育種過(guò)程中童期較漫長(zhǎng)，一般為5～7 a[5]，雌雄異株和幼苗期的性別很難分辨，對(duì)品種改良和育種工作造成阻礙。因此，對(duì)幼苗早期性別鑒定技術(shù)的研究將在極大程度上節(jié)約育種成本并縮短育種周期，在生產(chǎn)和遺傳育種上都有重要意義。【前人研究進(jìn)展】前人嘗試?yán)眯螒B(tài)學(xué)[6]、生理生化[7]和同工酶[8]等方法鑒別獼猴桃的性別，但常因環(huán)境因素的影響導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確度不高，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)在基因?qū)用骅b定親緣關(guān)系的方法越來(lái)越受到學(xué)者們的青睞。SSR（simple sequence repeat）分子標(biāo)記以個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)，可直接反映出生物個(gè)體遺傳變異，可以檢測(cè)出生物個(gè)體之間在核苷酸序列水平上的差異[9]，極大降低了環(huán)境因素的干擾，目前已在遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等各個(gè)方面有廣泛的應(yīng)用[10]，在獼猴桃等雌雄異株植物中可有效鑒定早期性別。目前，在開(kāi)發(fā)獼猴桃屬植物性別鑒定分子標(biāo)記的研究上取得了一些進(jìn)展，但暫未有毛花獼猴桃上的相關(guān)報(bào)道。使用山梨獼猴桃（Actinidia rufa）和中華獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）原變種的種間雜交后代F1群體進(jìn)行試驗(yàn)，在174個(gè)F1代個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證，利用RAD-seq技術(shù)開(kāi)發(fā)的SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記，最終篩選出A001、A002和A003這3個(gè)有較好特異性的分子標(biāo)記；A001為雌性特異標(biāo)記，具有較高的鑒定準(zhǔn)確性；A002和A003在雌、雄個(gè)體中均具有良好的差異性及多態(tài)性，可用于植株性別的鑒定；A003能夠區(qū)分山梨獼猴桃和中華獼猴桃原變種；組合使用A001和A002這2個(gè)標(biāo)記可有效鑒定中華獼猴桃和山梨獼猴桃性別[11]。UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408為‘和平紅陽(yáng)’獼猴桃上篩選出的在雌、雄株上表現(xiàn)出良好的差異性及多態(tài)性的SSR標(biāo)記，其多態(tài)性百分比均在88.9%以上，可鑒定植株性別[12]。

【本研究切入點(diǎn)】目前標(biāo)記A001、A002和A003不僅在前人研究所涉及的材料中進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證，在其它品種如軟棗獼猴桃上也已進(jìn)行了通用性驗(yàn)證[13]，其余標(biāo)記目前尚未有在其它栽培種類(lèi)上的通用性驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前關(guān)于毛花獼猴桃性別標(biāo)記的報(bào)道較少，本試驗(yàn)利用已知性別的野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源作為材料，旨在探討A001、A002、A003和UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404、UDK97-408兩組分子標(biāo)記在毛花獼猴桃性別鑒定中的通用性，以期為毛花獼猴桃育種群體的早期性別分子鑒定提供快捷、高效的方法，優(yōu)化生產(chǎn)上早期的雌雄配比，加快育種進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018—2019年進(jìn)行，材料來(lái)自江西省麻姑山，采用已知性別的毛花獼猴桃樣品10份（雌、雄各5株）。選擇標(biāo)準(zhǔn)為樹(shù)勢(shì)較強(qiáng)、生長(zhǎng)結(jié)果正常的成齡植株，采下其一年生枝蔓上的幼嫩葉片置于冰盒，隨后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移至裝滿吸水硅膠的自封袋中，充分脫水干燥后保存待用。

1.2 標(biāo)記來(lái)源

A001、A002及A003來(lái)自Zhang等，UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408來(lái)自楊妙賢等，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成提供，引物信息具體見(jiàn)表1。

1.3 DNA提取

使用北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA快速提取試劑盒，改良后的CTAB法提取DNA，選取獼猴桃雌雄株幼嫩葉片，放入自封袋中用硅膠充分脫水干燥，稱(chēng)取葉片100～200 mg，用磨樣機(jī)研磨至細(xì)粉狀。具體提取步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所得DNA使用紫外分光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并配合1%（ω）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量及完整性是否合格。將模板DNA質(zhì)量濃度稀釋至20 ng∕mL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，47～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28～34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min于12 ℃保存。對(duì)不同引物的退火溫度進(jìn)行多次檢驗(yàn)，篩選出最佳退火溫度，以期每個(gè)標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物中能產(chǎn)生清晰且長(zhǎng)度一致的多態(tài)性條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%（ω）非變性PAGE電泳，快速銀染法對(duì)條帶進(jìn)行檢測(cè)，拍照記錄后進(jìn)行分析。

表1 8個(gè)獼猴桃性別標(biāo)記引物信息Tab.1 Information of eight kiwifruit gender marker primers

2 結(jié)果與分析

2.1 A001、A002和A003標(biāo)記在毛花獼猴桃樣品中的驗(yàn)證結(jié)果

A001和A002 2個(gè)標(biāo)記在10個(gè)已知性別的毛花獼猴桃雌雄樣品基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果顯示，在A001和A002的擴(kuò)增產(chǎn)物中均出現(xiàn)了多態(tài)性條帶，但并未在雌雄株之間發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律，即2個(gè)標(biāo)記對(duì)毛花獼猴桃種質(zhì)資源均未能表現(xiàn)出性別特異性（圖1a）；對(duì)A003標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行觀測(cè)分析，未能檢測(cè)出清晰的多態(tài)性條帶（圖1b）。

圖1 A001、A002和A003標(biāo)記的驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 The outcome of A001，A002 and A003

2.2 UDK96-009、UDK96-013等5個(gè)標(biāo)記在毛花獼猴桃樣品中的驗(yàn)證結(jié)果

在對(duì)毛花獼猴桃基因組DNA擴(kuò)增最適退火溫度的多次檢驗(yàn)后，UDK96-009標(biāo)記均無(wú)法檢測(cè)出清晰的多態(tài)性條帶，結(jié)果與A003標(biāo)記結(jié)果類(lèi)似，無(wú)良好多態(tài)性；UDK96-013和UDK96-019標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物中均出現(xiàn)了多態(tài)性片段，但并未在雌雄株之間發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律，即2個(gè)標(biāo)記對(duì)毛花獼猴桃種質(zhì)資源均未能表現(xiàn)出性別特異性（圖2a）；UDK97-404和UDK97-408標(biāo)記分別在退火溫度為52 ℃和64 ℃時(shí)部分樣品擴(kuò)增出少量多態(tài)性條帶（圖2b），無(wú)良好多態(tài)性。

圖2 UDK96-013、UDK96-019和UDK97-404、UDK97-408標(biāo)記的驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 The outcome of UDK96-013，UDK96-019 and UDK97-404，UDK97-408

3 討論

對(duì)獼猴桃早期性別鑒定方法的研究在實(shí)踐中有重要意義，作為雌雄異株的經(jīng)濟(jì)作物，獼猴桃雌株產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值往往遠(yuǎn)高于雄株，但因其童期較長(zhǎng)且到達(dá)豐產(chǎn)的成熟期過(guò)長(zhǎng)[5]，導(dǎo)致早期雌、雄株很難分辨，所以在生產(chǎn)上合理配置雌雄個(gè)體對(duì)提高產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益顯得尤為關(guān)鍵。毛花獼猴桃的雄株相較于其它品種獼猴桃雄株不僅具有授粉的傳統(tǒng)作用，更具有花色艷麗、花青素含量高的特點(diǎn)[14]，在實(shí)際生產(chǎn)中可作為觀賞花推廣，其花瓣中富含的花青素在抗氧化、抗癌及預(yù)防慢性代謝性疾病等方面有著良好的功效[15]。王金碩等[16]在對(duì)雄性軟棗獼猴桃的研究發(fā)現(xiàn)，合理配置雄株具有確保產(chǎn)量、增加果實(shí)大小、減少畸形果和提高果實(shí)品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，所以合理配置雄株，可進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前對(duì)獼猴桃性別鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生理生化、同工酶鑒定和DNA分子標(biāo)記等。形態(tài)學(xué)鑒定主要通過(guò)對(duì)生殖器官的研究進(jìn)而區(qū)分雌雄株，觀察雌雄株獨(dú)有的器官或觀察其在發(fā)育過(guò)程中的獨(dú)特變化進(jìn)而判斷性別，對(duì)軟棗獼猴桃和狗棗獼猴桃的生殖器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)解剖，發(fā)現(xiàn)其雌花中的雄蕊退化，雄花中的雌蕊退化，但總體上雌花與雄花在表型上非常相似[17]；軟棗獼猴桃雌株葉痕間距和皮孔密度顯著大于雄株，而枝條顏色、橫切解剖結(jié)構(gòu)、葉柄粗細(xì)長(zhǎng)短和葉縱橫徑之比均未出現(xiàn)顯著差異[6]。生理生化是以雌雄植株在新陳代謝、特異蛋白質(zhì)和生理指標(biāo)等方面所體現(xiàn)出的差異為依據(jù)，對(duì)差異的分析鑒定雌雄株性別的一種方法，李旭等[6]通過(guò)BTB法、TTC法和總酚含量測(cè)定等方法，測(cè)定軟棗獼猴桃雌雄株在生理生化上的差異，在蘆筍[18]、栝樓[19]、楊梅[20]和復(fù)葉槭樹(shù)[21]等植物上有相似結(jié)果，但這些方法目前只應(yīng)用在成熟植株上，對(duì)童期植株是否使用還有待進(jìn)一步研究。同工酶屬于分子水平的指標(biāo)，雌雄株間的某些本質(zhì)差異可以通過(guò)其得以表現(xiàn)，這種方法通過(guò)對(duì)組織、發(fā)育及物種之間的特異性的檢測(cè)分析，找出編碼相應(yīng)酶的等位基因間的差異[22]，因此同工酶是基因差異在表達(dá)水平的體現(xiàn)。如陳曉玲等[23]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)6個(gè)獼猴桃品種雌雄株的酯酶同工酶和過(guò)氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，兩者在不同獼猴桃品種中均存在一定差異，但對(duì)雌雄株進(jìn)行酶譜分析時(shí)無(wú)特征條帶出現(xiàn)，同工酶在鑒別獼猴桃性別的研究上目前依舊主要集中在成熟植株上，童期植株的適用性鮮有研究。DNA分子標(biāo)記（DNA molecular markers）是DNA水平遺傳變異的直接反映，與其它方法相比，具有采樣要求低、測(cè)定結(jié)果易標(biāo)準(zhǔn)化和鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[24]，目前RAPD、SCAR和AFLP等DNA分子標(biāo)記常被用于獼猴桃性別鑒定研究，通過(guò)PCR技術(shù)與群體分離分析方法（Bulked Segregant Analysis，BSA）的結(jié)合，可在早期對(duì)雌雄異株植物的性別進(jìn)行鑒定，其方法是根據(jù)目標(biāo)性狀將分離群體分為2組，構(gòu)建在目標(biāo)基因區(qū)段存在差異的2個(gè)基因混合池，提取基因池中DNA作為模板進(jìn)行RAPD分析，2個(gè)基因混合池間多態(tài)性有差異的標(biāo)記與目的基因必定產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，Gill等[25]使用該方法開(kāi)發(fā)出可用于鑒定中華獼猴桃原變種為親本的3個(gè)家系（包括親本及其產(chǎn)生的F1代）的SmY1和SmX，在馬尾藻、巨體舌魚(yú)和黃連木的性別鑒定研究中均有應(yīng)用這種BSA混池測(cè)序技術(shù)，有較好的通用性。通過(guò)RAD-seq基因圖譜技術(shù)得到了本試驗(yàn)所使用的A001、A002和A003這3個(gè)SSR分子標(biāo)記，該技術(shù)能有效檢測(cè)DNA多態(tài)性，且可對(duì)基因組序列尚不清楚的物種進(jìn)行檢測(cè)，大多數(shù)模式生物及部分非模式生物都有應(yīng)用，如開(kāi)心果和西瓜等。除本試驗(yàn)中所選用的8個(gè)標(biāo)記，已開(kāi)發(fā)出可用于鑒定中華獼猴桃原變種和美味獼猴桃原變種植株性別的RAPD標(biāo)記S1032-850，但其尚未轉(zhuǎn)化為相對(duì)更穩(wěn)定、準(zhǔn)確率更高的SCAR標(biāo)記[26]，所以本文并未對(duì)其在毛花獼猴桃中的通用性進(jìn)行驗(yàn)證。

目前對(duì)獼猴桃性別鑒定方法的研究主要集中于上述幾種方法，隨著分子研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)性別分化相關(guān)基因的研究不斷深入，性別鑒定的研究深度便捷度、和準(zhǔn)確度都有了很大的提升。植物體中的微RNA（microRNA miRNA）長(zhǎng)約21 nt，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的方式參與調(diào)節(jié)多種植物發(fā)育和內(nèi)外應(yīng)答反應(yīng)，如花器官發(fā)育和花的性別分化等[27]。近年來(lái)，基于miRNA深度測(cè)序研究基因功能已在木瓜[28]、玉米[29]和楊樹(shù)[30]等多種植物之中都有應(yīng)用。閆明科等[31]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)進(jìn)行分析，對(duì)獼猴桃雌、雄花中表達(dá)的小RNA（sRNA）進(jìn)行鑒定，得出其中進(jìn)化上保守的miRNA，推測(cè)出新的雌、雄花特異miRNA，篩選出一批差異表達(dá)的miRNA并預(yù)測(cè)了其靶基因，從遺傳學(xué)角度為獼猴桃雌、雄株的性別分化研究奠定基礎(chǔ)[31]。但有研究表明，植物的性別并不絕對(duì)取決于其遺傳因子，植物激素和表觀遺傳修飾等因素也在一定程度上產(chǎn)生影響，因素之間相互獨(dú)立又共同作用，在以花為主的被子植物生殖器官表型上這些因素的作用結(jié)果得到表現(xiàn)，使得性別表型產(chǎn)生多樣性。獼猴桃染色體倍性復(fù)雜，如中華獼猴桃主要為二倍體和四倍體[32]，美味獼猴桃倍性較多，有四倍體、五倍體和六倍體[33]，毛花獼猴桃?guī)缀蹙鶠槎扼w[34]。從遺傳學(xué)角度來(lái)看，獼猴桃雜交后代群體的性別分化符合XY型性染色體性別決定系統(tǒng)[35]；對(duì)核型的進(jìn)一步觀察[36]和多基因連鎖圖譜的構(gòu)建[37]，發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃的XY染色體的長(zhǎng)度及外觀形態(tài)非常類(lèi)似，在被子植物性染色體進(jìn)化的六個(gè)時(shí)期中[38]的第二個(gè)時(shí)期，Y染色體上的亞端粒部位存在某些性別決定位點(diǎn)不能與X染色體自由重組，而這些缺乏重組的位點(diǎn)正是性別決定部位的特點(diǎn)[39]，同時(shí)在原始Y染色體上有一個(gè)小的雄性特異區(qū)形成，并且出現(xiàn)了全雄及全雌植株。據(jù)此發(fā)現(xiàn)，獼猴桃的性別分化表現(xiàn)與蘆筍類(lèi)似，認(rèn)為獼猴桃的性染色體應(yīng)處于進(jìn)化階段的第二個(gè)時(shí)期，此時(shí)Y染色體未能進(jìn)化完全，仍處于處于早期進(jìn)化階段。文中所使用的8個(gè)標(biāo)記均在中華獼猴桃原變種中得到驗(yàn)證，但在毛花獼猴桃上不具通用性，推測(cè)與以上原因有關(guān)，認(rèn)為毛花獼猴桃可能在性別特異區(qū)域位置或序列上與原文研究的獼猴桃品種有差異所導(dǎo)致。

此外，在其它雌雄異株植物上也有諸多性別標(biāo)記的報(bào)道，如杜仲[40]、甜瓜[41]和柿[42]等都已開(kāi)發(fā)出一系列用于鑒定性別的標(biāo)記。本文所使用的8對(duì)標(biāo)記均未有效鑒別出毛花獼猴桃的性別，分析認(rèn)為是獼猴桃性別決定符合孟德?tīng)栠z傳定律，表現(xiàn)為單基因控制的特點(diǎn)，但是現(xiàn)有研究仍然沒(méi)有找到獼猴桃性別決定相關(guān)的QTL。目前已有報(bào)道的的性別決定相關(guān)marker在獼猴桃屬不同種間存在局限性，因而，除了已報(bào)道的若干種外，其它獼猴桃種的性別鑒定需要開(kāi)發(fā)新的分析標(biāo)記。隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，今后獼猴桃性別鑒定的研究也會(huì)更傾向于基因?qū)用妫谔矫髌湫詣e表型形成的機(jī)理之前，利用多種鑒別方法相結(jié)合進(jìn)行性別鑒定，可在育種早期高效、精準(zhǔn)的鑒定性別，可降低育種成本，加快田間育種進(jìn)度，在發(fā)育早期更合理的配置雌雄植株，降低不必要的損耗，更好更快地促進(jìn)育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展做出保障。