王曉敏，董 璐＊，徐湘薇，張繼福，張 云，胡云峰*

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所∕中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；4.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東廣州 511458）

【研究意義】手性香料是一類(lèi)重要的化合物，不同對(duì)映體香料可顯示出不同的香氣特征、香氣強(qiáng)度和生物活性[1-3]。在眾多香料中，羧酸酯類(lèi)是一類(lèi)非常重要的香料。在食品香精中，酯類(lèi)香料是用途最廣、用量最大的一類(lèi)香料產(chǎn)品，它們經(jīng)合理配制可制成各種香型的香精，賦予白酒、無(wú)酒飲料、糕點(diǎn)、糖果以及其它食品所需香氣；同時(shí)它還廣泛用于配置各種香水、化妝品等日用品香精。（S）-乙酸蘇合香酯香味與所含對(duì)映體比例有關(guān)，如對(duì)映體過(guò)量值（e.e.）為78.3%的（S）-乙酸蘇合香酯帶有鱷梨的青香味和草莓醬的香味；而e.e.為81.1%的（R）-乙酸蘇合香酯帶有杏香、蘋(píng)果香和草莓醬香味[1,4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通常，手性化合物的合成可以通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)方法合成，但是化學(xué)合成需要有毒有機(jī)溶劑及重金屬的參與，對(duì)環(huán)境及人類(lèi)具有嚴(yán)重的危害，同時(shí)還會(huì)破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，并且通過(guò)化學(xué)合成得到的手性化合物的光學(xué)純度較低[5]。此外，手性化合物還可以通過(guò)生物催化劑的方法進(jìn)行制備[6-10]。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，酶法選擇性拆分消旋體化合物，具有高立體專(zhuān)一性和區(qū)域選擇性、副反應(yīng)少、產(chǎn)率高、產(chǎn)物光學(xué)純度好以及反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，是一種被廣泛認(rèn)可的拆分方法[11-13]。微生物是許多有價(jià)值的酶、蛋白質(zhì)、高附加值的多不飽和脂肪酸等的重要來(lái)源，而大部分的代謝產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)，酶法破碎細(xì)胞技術(shù)具備條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)易和利于環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。因此，國(guó)內(nèi)外的專(zhuān)家學(xué)者在這一領(lǐng)域進(jìn)行了一系列廣泛而深入的研究[14]。劉紅等[15]采用酶解和超聲波相結(jié)合的方式進(jìn)行了大腸桿菌的破碎實(shí)驗(yàn)研究，確定了此方法可獲得純度更高的包涵體。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，利用溶菌酶破碎Bacillussp.DL-2以獲取胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯效果較好[16]。

【本研究切入點(diǎn)】游離酶由于在水溶液中不穩(wěn)定、重復(fù)利用性差、不易回收和反應(yīng)產(chǎn)物難以分離等缺點(diǎn)，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。而工業(yè)酶經(jīng)過(guò)固定化后可以克服這些缺點(diǎn)，提高其穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，實(shí)現(xiàn)操作連續(xù)性使其經(jīng)濟(jì)高效[17-19]。工業(yè)酶的固定化方法主要有物理吸附法、離子結(jié)合法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法[20]。吸附法是常用的酶固定化方法之一，以吸附法固定酶，酶的構(gòu)象很少改變或基本不變，因此，酶的催化活力損失少；另外載體選擇范圍較廣，價(jià)格低廉，固定化操作過(guò)程簡(jiǎn)單，因此吸附法在經(jīng)濟(jì)上是最具吸引力的固定化方法[21]。硅藻土由硅藻的細(xì)胞壁沉積而成，硅藻土表面的多孔性與負(fù)電性使其呈現(xiàn)明顯表面吸附性，因而被常用做吸附載體。硅藻土表面還存在有大量的硅羥基及氫鍵，這些硅羥基及氫鍵同時(shí)存在于硅藻土眾多的微孔之中，這些也是硅藻土具備吸附性能的重要原因[22]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本工作利用溶菌酶破碎Bacillussp.DL-2獲取胞內(nèi)蛋白酶，采用硅藻土固定化胞內(nèi)蛋白酶以拆分乙酸蘇合香酯，通過(guò)優(yōu)化吸附固定化條件以及拆分條件，制備了高光學(xué)純的（S）-乙酸蘇合香酯，為工業(yè)化生產(chǎn)（S）-乙酸蘇合香酯提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 從西太平洋深海沉積物中篩選并鑒定出一株芽孢桿菌Bacillussp.DL-2。

1.1.2 主要儀器 MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于日本SANYO公司，OJS-2012R型恒溫?fù)u床購(gòu)于上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，Allegra X-30R型冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，F(xiàn)ULI GC-9700II型氣相色譜儀購(gòu)于浙江福立分析儀器股份有限公司，ACB-4A1型垂直流超凈工作臺(tái)購(gòu)于新加坡藝思高（ESCO）科技有限公司，MDF-U73V型-80 ℃低溫冰箱購(gòu)于日本SANYO公司，KB-5010型振蕩器購(gòu)于海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，SPL-250型生化培養(yǎng)箱購(gòu)于天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.1.3 主要試劑 高蛋白脫脂高鈣奶粉（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司），乙酸蘇合香酯（上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司），酵母提取粉和胰蛋白胨（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司），溶菌酶（生工生物工程上海股份有限公司），硅藻土（天津大茂化學(xué)試劑公司），其他試劑皆為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基（1）脫脂奶粉固體培養(yǎng)基:1%脫脂奶粉水溶液加1%瓊脂后高壓滅菌待冷卻到50 ℃左右倒平板。（2）種子培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）:1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:1%脫脂奶粉水溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胞內(nèi)蛋白酶的制備 將保存于-80 ℃的Bacillussp.DL-2用脫脂奶粉固體培養(yǎng)基活化后，接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)基變澄清），然后離心去掉上清液，磷酸（PB）緩沖液清洗2次細(xì)胞，取濕重細(xì)胞0.5 g，加入1 mg∕mL的溶菌酶溶液20 mL，35 ℃震蕩破碎30 min，離心后去掉細(xì)胞殘?jiān)?，其上清液即為該菌的胞?nèi)蛋白酶溶液。

1.2.2 硅藻土固定化Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶的條件優(yōu)化 溫度的優(yōu)化。每1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液加入50 g的硅藻土，分別在20，25，30，35，40，45，50，55 ℃下震蕩固定化8 h，震蕩器轉(zhuǎn)速為200 r∕min，檢測(cè)溫度對(duì)固定化效果的影響。

pH的優(yōu)化。將胞內(nèi)蛋白酶液的pH分別調(diào)成5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，每1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液加入50 g的硅藻土，在最優(yōu)溫度40 ℃下震蕩固定化8 h，震蕩器轉(zhuǎn)速為200 r∕min，檢測(cè)不同pH對(duì)固定化效果的影響。

時(shí)間的優(yōu)化。在1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液中加入50 g的硅藻土，調(diào)節(jié)pH至7，40 ℃，200 r∕min震蕩條件下分別固定化2，4，6，8，10，12，14 h，檢測(cè)不同固定化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響。

載體量的優(yōu)化。每1 L pH為7的胞內(nèi)蛋白酶溶液分別加入10，20，40，50，60，80，100 g硅藻土，40 ℃，200 r∕min震蕩條件下固定化10 h，檢測(cè)不同載體量對(duì)固定化效果的影響。

1.2.3 硅藻土固定化Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶的制備 將胞內(nèi)蛋白酶液pH調(diào)至7，每1 L蛋白酶液加入100 g硅藻土，40 ℃、200 r∕min振蕩器中固定化10 h，抽濾后于30 ℃烘干箱中烘干，即得硅藻土固定化的胞內(nèi)蛋白酶。

1.2.4 固定化的胞內(nèi)蛋白酶制備（S）-乙酸蘇合香酯 固定化酶濃度的影響。pH為7的PB緩沖液中分別加入120，160，200，240，280，320 mg∕mL固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于35 ℃震蕩反應(yīng)8 h，用氣相檢測(cè)拆分效果。

拆分時(shí)間的影響。pH為7的PB緩沖液中加入160 mg∕mL固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于35 ℃分別震蕩反應(yīng)2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h，用氣相檢測(cè)拆分效果。

拆分溫度的影響。pH為7的PB緩沖液中加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，分別于20，25，30，35，40，45，50 ℃條件下震蕩反應(yīng)7 h，用氣相檢測(cè)拆分效果。

拆分pH的影響。配制不同pH（5-9）的緩沖液，加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于30 ℃下震蕩反應(yīng)7 h，氣相檢測(cè)拆分效果。

金屬離子的影響。用pH為7的PB緩沖液配制2 mmol∕L的金屬離子溶液（Li+，Na+，K+，Ba2+，Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Ni2+，Al3+，F(xiàn)e2+，Mn2+），分別加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于30 ℃下震蕩反應(yīng)7 h，氣相檢測(cè)拆分效果。

1.2.5 固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性 按照最佳固定化條件制備一批固定化酶保存于4 ℃冰箱內(nèi)，在最優(yōu)拆分條件下每周測(cè)試1次固定化酶拆分效果，連續(xù)檢測(cè)一個(gè)月。

1.2.6 氣相檢測(cè)方法及分析方法 拆分反應(yīng)完畢立即加入與拆分體系等量的乙酸乙酯，2 000 r∕min，震蕩萃取2 min，離心后取上層有機(jī)相進(jìn)氣相檢測(cè)。氣相檢測(cè)條件為:注射器溫度210 ℃，檢測(cè)器溫度210 ℃，載氣為N2，流速1.2 mL∕min，采用梯度升溫進(jìn)行分析:80 ℃保持1 min，10 ℃∕min升溫到120 ℃，120 ℃保持1 min，15 ℃∕min升溫到210 ℃，保持1 min。

（S）-乙酸蘇合香酯的對(duì)映體過(guò)量值（e.e.）及轉(zhuǎn)化率（C）按如下公式計(jì)算[23]，各因素下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

e.e.代表（S）-乙酸蘇合香酯的對(duì)映體過(guò)量值，Sac和Rac分別表示反應(yīng)后（S）-乙酸蘇合香酯和（R）-乙酸蘇合香酯的峰面積；C為轉(zhuǎn)化率，R0、S0分別代表反應(yīng)前對(duì)應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度，R、S分別代表反應(yīng)后對(duì)應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶條件確定

圖1 固定化Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶條件優(yōu)化Fig.1 The optimization of the conditions of immobilizing intracellular proteases of Bacillus sp.DL-2

2.1.1 溫度的影響 在固定化階段，以拆分轉(zhuǎn)化率為檢測(cè)指標(biāo)。拆分轉(zhuǎn)化率越高，說(shuō)明固定化酶量越多；反之，則固定化酶越少。由圖1（a）可知，固定化溫度為20～35 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率在50%左右，當(dāng)固定化溫度升至40 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值89.5%，說(shuō)明此條件下固定化酶效果最好；隨著溫度的繼續(xù)升高，轉(zhuǎn)化率急劇下降至10%以下，溫度過(guò)高會(huì)破壞胞內(nèi)蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，影響酶的催化活性。因此，選擇40 ℃為最佳固定化溫度。

2.1.2 pH的影響 由圖1（b）可知，當(dāng)pH為5和9時(shí)，固定化效果不佳，拆分乙酸蘇合香酯的轉(zhuǎn)化率都在30%以下，當(dāng)pH升至5.5～8.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率在90%左右，均達(dá)到了一個(gè)較高的轉(zhuǎn)化率水平，考慮破碎細(xì)胞時(shí)所用緩沖液pH即為7，為減少工業(yè)化操作復(fù)雜性，選擇pH為7為最佳固定化pH。

2.1.3 時(shí)間的影響 由圖1（c）可知，固定化時(shí)間小于6 h時(shí)，拆分轉(zhuǎn)化率處于一個(gè)較低的水平，均低于30%，此時(shí)硅藻土孵育時(shí)間較短，硅藻土只吸附了少量的蛋白酶，當(dāng)超過(guò)6 h后，固定化效果有了一個(gè)明顯的提升，轉(zhuǎn)化率均高于90%，并在10 h時(shí)達(dá)到最高值95.3%，此時(shí)吸附胞內(nèi)酶量最大，但超過(guò)10 h后，吸附效果沒(méi)有明顯提升，從節(jié)省工業(yè)化制備固定化酶時(shí)間考慮，選擇固定化10 h為最佳固定化時(shí)間。

2.1.4 載體量的影響 由圖1（d）可知，載體量對(duì)固定化的效果影響不大，轉(zhuǎn)化率基本都維持在90%左右，當(dāng)載體添加量為100 g∕L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最佳值97.2%，同時(shí)考慮載體量添加量越大，固定化酶產(chǎn)量也越多，但高于100 g∕L時(shí)可能會(huì)造成胞內(nèi)酶液與硅藻土接觸面積減少，影響硅藻土吸附胞內(nèi)蛋白酶效果，且載體量的增加也會(huì)要求更高頻的震蕩以使酶液與固定化載體接觸充分，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言需要加大投資得不償失，因此選擇100 g∕L為最佳載體添加量。

2.2 固定化酶制備（S）-乙酸蘇合香酯

圖2 固定化酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯的條件優(yōu)化Fig.2 The optimization of the conditions of preparing（S）-phenylethyl acetate using immobilized enzyme

2.2.1 固定化酶量對(duì)拆分的影響 檢測(cè)固定化酶拆分效果時(shí)，要綜合考慮轉(zhuǎn)化率及e.e.值。由圖2（a）可知，當(dāng)固定化酶添加量為120 mg∕mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率和（S）-乙酸蘇合香酯的e.e.值均較低，添加酶量過(guò)少，不足以將（±）-乙酸蘇合香酯拆分完全，轉(zhuǎn)化率隨固定化酶添加量的增加逐漸升高，在200 mg∕mL后基本保持不變，說(shuō)明添加固定化酶量已基本飽和；（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值在160 mg∕mL時(shí)達(dá)到最大值89.1%，固定化酶量大于160 mg∕mL后，e.e.值呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，因此，綜合考慮，選擇最佳固定化酶添加量為160 mg∕mL。

2.2.2 時(shí)間對(duì)拆分的影響 由圖2（b）可知，隨著時(shí)間的增加，拆分轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值逐漸升高并在7 h時(shí)均達(dá)到最高值，拆分時(shí)間超過(guò)7 h后轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值呈現(xiàn)波動(dòng)下降趨勢(shì)，長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)并不能優(yōu)化固定化酶的使用效果，綜合考慮e.e.值及轉(zhuǎn)化率，選擇7 h為最佳拆分時(shí)間。

2.2.3 溫度對(duì)拆分的影響 由圖2（c）可知，溫度在20～30 ℃時(shí)固定化酶拆分轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高逐漸增大，（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值基本保持不變，均在91%左右，且轉(zhuǎn)化率在30 ℃時(shí)達(dá)到最佳值，超過(guò)30 ℃后，隨溫度上升，拆分轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值均逐漸降低，溫度過(guò)低會(huì)影響固定化酶的活性作用的發(fā)揮，溫度過(guò)高可能會(huì)使吸附于硅藻土上的固定化酶脫落，使固定化酶轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酶，使胞內(nèi)蛋白酶更易受高溫的破壞，綜合考慮e.e.值及轉(zhuǎn)化率，選擇30 ℃為最佳拆分溫度。

圖3 金屬離子對(duì)固定化酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯的影響Fig.3 The effect of metal ions on preparing（S）-phenylethyl acetate using immobilized enzyme

2.2.4 pH對(duì)拆分的影響 由圖2（d）可知，拆分效果隨pH的增加呈逐漸上升的趨勢(shì)，并在pH為7時(shí)e.e.值達(dá)到最大值，超過(guò)7后，隨pH增加拆分效果呈現(xiàn)波動(dòng)下降的趨勢(shì)，但下降趨勢(shì)不明顯，e.e.值保持在90%左右，轉(zhuǎn)化率在60%左右，固定化酶在中性及堿性條件下仍能很好的發(fā)揮其拆分作用，用硅藻土固定化胞內(nèi)蛋白酶增加了固定化酶對(duì)堿性環(huán)境的耐受程度，因此，選擇pH為7為最佳拆分pH。

2.2.5 金屬離子對(duì)拆分的影響 由圖3可知，對(duì)照組e.e.值為87.0%，與對(duì)照組相比，Cu2+、Na+會(huì)稍微降低固定化酶拆分效果，分別使e.e.值降為63.3%及53.0%，其余金屬離子對(duì)固定化酶的拆分效果影響不大，e.e.值均維持在80%左右，所檢測(cè)的12種金屬離子轉(zhuǎn)化率均高于40%。硅藻土固定化酶降低了胞內(nèi)蛋白酶對(duì)金屬離子的敏感程度，對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求較低，在工業(yè)生產(chǎn)中具備一定的參考意義。

圖4 固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.4 Storage stability of immobilized enzyme

2.3 固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性

由圖4可知，4 ℃保存1周的固定化酶拆分轉(zhuǎn)化率和（S）-乙酸蘇合香酯的e.e.值最高，隨保存周數(shù)的增加，e.e.值及轉(zhuǎn)化率均逐漸降低，但在4周后e.e.值仍能達(dá)到90.1%，轉(zhuǎn)化率保持在66.6%左右，后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展中仍有進(jìn)一步提升其儲(chǔ)存穩(wěn)定性的必要。

3 討論

（S）-乙酸蘇合香酯是重要的手性藥物中間體和手性化工產(chǎn)品。傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法需要添加有機(jī)溶劑及重金屬，對(duì)環(huán)境危害大，且制備的手性化合物光學(xué)純度不高[5]。近年來(lái)，酶法選擇性拆分制備手性化合物因其更加經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保而備受關(guān)注[24-26]。公顏慧等[27]通過(guò)對(duì)pH、溫度、有機(jī)溶劑等反應(yīng)條件的優(yōu)化提高酯酶手性拆分乙酸蘇合香酯的光學(xué)純度。曹瑩瑩等[28]利用來(lái)源南海深海的微生物酯酶EST12-7不對(duì)稱(chēng)水解反應(yīng)拆分制備了高光學(xué)純的（R）-2-氯丙酸乙酯。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中篩選并鑒定出一株芽孢桿菌Bacillussp.DL-2，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，其胞外蛋白酶及全細(xì)胞均可手性拆分（±）-乙酸蘇合香酯[29-31]，進(jìn)一步破碎細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)蛋白酶同樣可以拆分（±）-乙酸蘇合香酯，通過(guò)優(yōu)化破碎細(xì)胞方法，確定了使用1 mg∕mL的溶菌酶在pH為7，35 ℃的條件下破碎30 min所得到胞內(nèi)蛋白酶具備良好的拆分（±）-乙酸蘇合香酯效果[16]。

但游離的胞內(nèi)蛋白酶對(duì)環(huán)境高度敏感、不穩(wěn)定且可變性大，而且酶催化劑的價(jià)格通常很高，難以在反應(yīng)體系中分離回收，這些問(wèn)題導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，成為酶工業(yè)化的技術(shù)瓶頸，并限制了游離酶的廣泛應(yīng)用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，酶的固定化技術(shù)被提出。酶在固定化后仍然具有較高的酶活力和回收率，而且固定化后酶的穩(wěn)定性和耐受性等重要工業(yè)性能都有相應(yīng)的提高[32-33]。因此，相對(duì)游離酶，固定化酶更具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其應(yīng)用更加廣泛[34-37]。

吸附法是一種常見(jiàn)的固定化方法，屬于物理法固定化酶的一種，其優(yōu)點(diǎn)在于酶不參加化學(xué)反應(yīng)，整體結(jié)構(gòu)保持不變，酶的催化活性得到很好保留，采用吸附法固定酶，其操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起酶變性或失活，且載體廉價(jià)易得，十分適合工業(yè)化生產(chǎn)。硅藻土作為一種價(jià)格低廉的吸附載體而備受關(guān)注[22]，硅藻土是一種硅質(zhì)巖石，它主要由古代硅藻的遺骸所組成，其化學(xué)成分以SiO2為主，顯微鏡下可觀察到天然硅藻土的特殊多孔性構(gòu)造，這種微孔結(jié)構(gòu)是硅藻土具有特征理化性質(zhì)的原因。固定化酶受固定化條件的影響較大，固定化溫度、時(shí)間、pH均能影響酶和硅藻土之間的相互作用，因此，確定最佳固定化條件極為重要。固定化的Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶可不對(duì)稱(chēng)拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯，為獲得最佳轉(zhuǎn)化率及e.e.值，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定了制備（S）-乙酸蘇合香酯的最佳拆分條件，為工業(yè)化制備（S）-乙酸蘇合香酯提供了參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶固定化，利用硅藻土為吸附載體對(duì)Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶進(jìn)行固定化，因吸附法主要依靠蛋白質(zhì)和載體之間的結(jié)合力聯(lián)結(jié)，溫度、pH、固定化時(shí)間等因素均可影響吸附效果，本工作經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定了最佳固定化條件為:溫度40 ℃，pH為7，固定化時(shí)間10 h，載體添加量100 g∕L。在最佳固定化條件下制備了固定化酶，優(yōu)化確定了制備（S）-乙酸蘇合香酯的最佳拆分條件為:固定化酶用量為160 mg∕mL，拆分時(shí)間7 h，拆分溫度30 ℃，緩沖液pH為7。在最佳固定化及拆分條件下，制備的（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值可達(dá)到96.8%，轉(zhuǎn)化率為73.9%（圖5），優(yōu)化后氣相色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖如圖6所示。固定化酶在4 ℃條件下儲(chǔ)存4周后仍具備較高的酶拆分活性，且對(duì)低濃度的金屬離子敏感度性較低，后續(xù)將繼續(xù)篩選更優(yōu)良的固定化載體，以期為工業(yè)化制備高光學(xué)純度的（S）-乙酸蘇合香酯做參考。

圖5 使用硅藻土固定化的Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯Fig.5 Preparation of（S）-phenylethyl acetate by immobilized intracellaluar proteases using diatomite of Bacillus sp.DL-2

圖6 硅藻土固定化的胞內(nèi)蛋白酶制備（S）-乙酸蘇合香酯的氣相圖譜Fig.6 The gas chromatogram of（S）-phenylethyl acetate prepared by immobilized enzyme