王 盈

（中國鐵路哈爾濱局集團有限公司 哈爾濱鐵路疾病預(yù)防控制中心海拉爾分中心，內(nèi)蒙古 海拉爾021000）

沙門氏菌是一種常見的引起人類、動物發(fā)病及食物中毒的食源性致病菌之一，極易污染水源、食品等，對人類健康造成危害，在食品檢測中具有重要意義[1-2]。此次能力驗證由市場監(jiān)督管理局監(jiān)管、食品檢驗檢測中心承擔，是考核實驗室能力的一次檢測，此次的能力驗證不僅是對檢測人員的考察，對促進實驗室發(fā)現(xiàn)問題、提高檢驗檢測水平也有積極意義[3-4]，針對考核情況進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品編號為SLM9-19010 和SLM9-19016，為2 個西林瓶密封的質(zhì)控球，由某食品檢驗檢測中心提供。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂、蛋白胨水靛基質(zhì)試劑、尿素瓊脂、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒，均購置于北京某公司。所有培養(yǎng)基及試劑均驗證合格并在有效期內(nèi)。

采用恒溫恒濕培養(yǎng)箱(BSC-250，36℃)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-420，42℃)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(BXM-30R)。

1.3 方法

根據(jù)組織方要求，樣品前處理應(yīng)按照作業(yè)指導書進行，后續(xù)檢測依據(jù)《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4—2016)[5]進行。

1.3.1 樣品前處理

檢測前，先將未開啟的質(zhì)控球置于室溫條件下，待恢復(fù)至室溫后(約15 min)，無菌操作打開編號SLM9-19010 和SLM9-19016 西林瓶的鋁塑蓋和膠塞，用25 mL 無菌生理鹽水完全溶解質(zhì)控樣品，振蕩混勻。待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復(fù)用稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中。此溶液即為待測樣品溶液，記為SLM9-19010 待測樣品溶液和SLM9-19016待測樣品溶液。

1.3.2 預(yù)增菌和增菌

將SLM9-19010和SLM9-19016待測樣品溶液分別轉(zhuǎn)移至盛有225 mL滅菌的BPW均質(zhì)袋中，振蕩混勻，于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；預(yù)增菌后輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，分別吸取1 mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液中，TTB混合增菌液于42℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，SC混合增菌液于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液做空白對照。

1.3.3 分離培養(yǎng)

用直徑3 mm的無菌接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂、XLD瓊脂、HE瓊脂和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板；BS瓊脂在36℃下培養(yǎng)48 h，XLD瓊脂、HE 瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板在36℃下培養(yǎng)24 h，并做空白對照，培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落生長情況。

1.3.4 生化鑒定

在HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌顯色、BS瓊脂平板上挑取可疑菌落，分別接種在三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗管、對照管各1 支同時接種蛋白胨水、尿素、KCN 培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂平板于36℃培養(yǎng)24 h；為確保生化鑒定結(jié)果，同時采用沙門氏菌生化鑒定試劑盒進行鑒定，根據(jù)試劑盒說明書從新鮮培養(yǎng)的單個純菌落用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?，同時接種于三糖鐵生化管，24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性平板分離

將增菌液劃線與多個平板進行劃線培養(yǎng)，2 份樣品SLM9-19010和SLM9-19016在各平板上的菌落形態(tài)如表1所示。

表1 選擇平板上的菌落形態(tài)

2.2 菌落的生化反應(yīng)

樣品SLM9-19010在各個平板上都沒有典型菌落。樣品SLM9-19016 在各個平板上都有典型菌落。挑取SLM9-19016 中2 個HE 瓊脂平板藍綠色中心帶黑色菌落(編號分別為SLM9-19016-1，SLM9-19016-2)，2 個XLD瓊脂平板黑色菌落(編號分別為SLM9-19016-3和SLM9-19016-4)，2 個沙門顯色培養(yǎng)基淡紫色菌落(編號分別為SLM9-19016-5和SLM9-19016-6)，2個BS瓊脂平板黑色帶金屬光澤菌落(編號分別為SLM9-19016-7和SLM9-19016-8)進行生化鑒定，以上菌落經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂平板純化培養(yǎng)后，再進行沙門氏菌生化鑒定試劑盒鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 SLM9-19016生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)生化鑒定結(jié)果SLM9-19016-1到SLM9-19016-8都為同一種菌，并且為沙門氏菌屬；SLM9-19010 未檢出沙門氏菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 檢測結(jié)果

本次能力驗證通過預(yù)增菌和選擇性增菌后，用HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌顯色、BS瓊脂平板進行篩選，平板上均出現(xiàn)可疑沙門氏菌，尤其在沙門顯色培養(yǎng)基中出現(xiàn)了典型菌落，經(jīng)分離純化后進行生化試劑盒鑒定，鑒定出SLM9-19010 未檢出沙門氏菌，SLM9-19016檢出沙門氏菌屬。

3.2 分析討論

（1）樣品分離。在打開樣品進行初步分離時，必須按照要求操作，在室溫放置一段時間，同時增菌液的次數(shù)按要求加入且反復(fù)吹打，盡量使西林瓶內(nèi)的所有細菌都洗脫出來，如果樣品中所含細菌量少，不按此步驟易造成細菌漏檢。

（2）避免交叉污染。在實驗過程中最好使用帶濾芯的槍頭以防吸液時樣液沖入移液器而污染其他樣品。在樣品開啟前、預(yù)增菌和增菌、接種TTB增菌液和SC增菌液、劃線分離過程中每個樣品應(yīng)獨立進行，防止樣品之間交叉污染和樣品混淆。

（3）培養(yǎng)基選擇。本次按照國家標準規(guī)定方法進行檢驗時，沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)尤為重要，因其在不同的培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不一，BS瓊脂培養(yǎng)基需要培養(yǎng)48 h；沙門顯色培養(yǎng)基屬于強選擇性培養(yǎng)基，沙門菌屬在此培養(yǎng)基的菌落易識別。檢測采用了BS瓊脂、HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基，多種培養(yǎng)基可以相互佐證以給予更好的證據(jù)支持。

（4）平板分區(qū)劃線。在平板進行細菌分離中，劃線培養(yǎng)是很重要的一步，在分區(qū)劃線時，應(yīng)進行多區(qū)劃線，避免菌落出現(xiàn)彌漫性生長，從而不好挑取單個純種菌落進行生化實驗。進行生化鑒定時，選用多個特征性菌落可以避免漏篩，生化鑒定應(yīng)選擇品質(zhì)較好的試劑且需把控質(zhì)量。

（5）生物安全。在整個實驗過程中應(yīng)注意生物安全，避免操作人員被感染，實驗結(jié)束后對培養(yǎng)物盡快進行無害化處理，避免污染環(huán)境。

4 結(jié)束語

參加能力驗證是實驗室保持技術(shù)能力的一種有效方式，此次對乳粉中沙門氏菌的檢驗，考察檢驗人員技術(shù)能力，使實驗室可以發(fā)現(xiàn)問題、及時改進糾正，確保檢驗檢測達到質(zhì)量要求。