鄭曉婷，蔣 紅，王宏軍

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州121001）

四黃止痢復(fù)方中藥組方中以黃連、黃芩為主藥，黃連瀉心火兼瀉中焦火，黃芩瀉肺火于上焦；輔以大黃泄熱通腸，清除胃腸濕熱積滯，且板藍(lán)根清熱解毒，并助主藥解熱，為輔藥；黃檗瀉腎火于下焦為佐藥；甘草清熱解毒，諸藥合用具有清熱解毒、澀腸止瀉之功效[1]。主治大腸桿菌類疾病，同時(shí)還可有效預(yù)防和治療鴨疫里莫氏桿菌、仔豬黃白痢、流行性、細(xì)菌性、濕熱性腹瀉的防治，還可用于種蛋消毒[2-4]。納米藥物是納米技術(shù)與藥學(xué)相結(jié)合后研發(fā)的一種新劑型。納米制劑與其他劑型比較來說其粒徑更小、比表面積更大、表面反應(yīng)活性更高、活性中心更多。納米制劑可以有效提高中藥的溶解度，提升生物利用度，提升藥物療效，起到緩釋控釋作用和靶向作用。納米制劑可以在保證藥效的同時(shí)降低毒性、副作用以及減少用藥量[5]。文章旨在研究制備四黃止痢復(fù)方中藥納米乳，并對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、78-1 磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）、HC-1000V 型粉碎機(jī)（永康市天琪盛世工貿(mào)有限公司）、0.22 μm 微孔過濾膜（錦州市眾源實(shí)驗(yàn)經(jīng)銷處）、上海雷磁PHS-3C 臺式酸度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（北京金北德工公司）。

1.2 試驗(yàn)材料

大黃提取物（西安瑞林生物科技有限公司）、黃芩提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黃連提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黃檗提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、板藍(lán)根提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、甘草提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、IPM（上海麥克林生化科技有限公司）、油酸乙酯（濟(jì)南匯錦川商貿(mào)有限公司）、聚氧乙烯40 蓖麻油（山東信恒化工有限公司）、聚乙二醇（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）、聚山梨醇酯（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）、1，2 丙二醇（天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司）、丙三醇（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）、吐溫80（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）、蘇丹紅Ⅲ（上海瀚思化工有限公司）、亞甲藍(lán)（上海瀚思化工有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 繪制偽三元相圖

按油相、水相、表面活性劑與助表面活性劑混合相在臨界點(diǎn)是其各自的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，用等邊三角形的三條邊分別表示水相、油相以及表面活性劑與助表面活性劑混合相[6]，用Origin 8.5 軟件繪制該納米乳的偽三元相圖，篩選出最優(yōu)處方。

1.3.2 處方的選擇

1.3.2.1 油相的選擇

納米乳中使用的油應(yīng)與表面活性劑保持互相作用，而且易于成膜[7]。油相鏈越短，油相越易滲透到膜中，碳?xì)滏溤介L的油相，則會提高藥物的溶解度。本試驗(yàn)待選油相有肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、大豆油、油酸乙酯、橄欖油。

1.3.2.2 表面活性劑的選擇

表面活性劑可根據(jù)親水親油平衡（HLB）值進(jìn)行篩選，HLB值在3～8的乳化劑可制備成W/O型納米乳，HLB值在8～16 的乳化劑可制備O/W 型納米乳[8]。本試驗(yàn)待選表面活性劑和HLB 值均大于7，分別為吐溫80、聚氧乙烯蓖麻油（RH40）、聚山梨醇酯、泊洛沙姆（HLB 值高于20 的通常作為助表面活性劑來調(diào)節(jié)總體HLB值，以求達(dá)到納米乳制備所需的條件）。

1.3.2.3 助表面活性劑的選擇

助表面活性劑在納米乳的形成過程中可以協(xié)調(diào)降低水相、油相的表面張力，增加表面活性劑的溶解度[9]，一般選擇中鏈、短鏈醇。本試驗(yàn)以聚乙二醇、1，2 丙二醇、無水乙醇、丙三醇作為助表面活性劑。

1.3.2.4 表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比（Km）的確定

將表面活性劑吐溫80、助表面活性劑丙三醇、油相IPM混合成乳，分別選擇Km值為0.5、1、2、3制作偽三元相圖，觀察圖中成乳區(qū)域面積的大小、乳化顆粒在乳液中的性質(zhì)、乳化程度及體系穩(wěn)定性，來確定最佳Km值。

1.3.2.5 含藥納米乳的制備

精確稱量IPM、吐溫80、丙三醇、水于燒杯中，室溫下借助磁力攪拌機(jī)攪拌至澄清即得空白納米乳。分多次少量將四黃止痢提取物（ECCS）加入制備好的空白納米乳中，觀察ECCS的用量。

1.3.3 質(zhì)量評價(jià)

1.3.3.1 納米乳的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

肉眼觀察外觀形態(tài)，平行光照射，乳滴粒徑檢測。

1.3.3.2 鑒別試驗(yàn)取兩份2～3 mL 四黃止痢納米乳（ECCS-NE）分別加入2 支試管中，再分別向2 支試管中加入蘇丹紅Ⅲ和甲基藍(lán)溶液1～2滴，觀察到紅、藍(lán)兩溶液的擴(kuò)散速度快，若蘇丹紅Ⅲ溶液擴(kuò)散比甲基藍(lán)擴(kuò)散快，則ECCS-NE 為W/O 型。若甲基藍(lán)溶液擴(kuò)散的比蘇丹紅Ⅲ溶液擴(kuò)散快，則ECCSNE為O/W型[10]。

1.3.3.3 粒徑分布及Zeta電位

送至北京中科百測負(fù)染電鏡觀察納米乳形態(tài)。

1.3.3.4 pH值

取l0 mL ECCS-NE，置于燒杯中，用pHS-3C 型精密酸度計(jì)測定pH值。

1.3.4 穩(wěn)定性

1.3.4.1 光照試驗(yàn)

根據(jù)《中國藥典》2015版，將3組不同批次制備的納米乳置于4000～5000 lux 強(qiáng)度下進(jìn)行光照，分別于0、5、10 d觀察納米乳外觀狀態(tài)、pH值。

1.3.4.2 溫度試驗(yàn)

根據(jù)《中國藥典》2015 版，將3 組不同批次制備的9 管納米乳于25、50、70 ℃，相同濕度下放置，分別于0、5、10 d時(shí)觀察納米乳狀態(tài)。

1.3.4.3 濕度試驗(yàn)

將3 組不同批次制備的6 管納米乳于70%、90%濕度于密閉容器室溫放置，分別于0、5、10 d 時(shí)觀察納米乳狀態(tài)。

1.3.4.4 離心試驗(yàn)

高速離心可有效評價(jià)納米乳體系的穩(wěn)定性，取5 mL ECCS-NE 于離心管中，在室溫下10000 r/min 離心25 min，觀察樣品狀態(tài)。

1.3.4.5 靜置試驗(yàn)

取一定量的樣品于密閉容器25 ℃放置0、10、30、60 d。

1.3.5 包封率和載藥量

量取制備的ECCS-NE10 mL，加甲醇在25 mL容量瓶中定容，超聲10 min，吸取1 mL加甲醇于5 mL容量瓶中定容。0.22 μm微孔過濾膜濾過待檢，所得藥物含量W1，3次平行試驗(yàn)。再次量取制備的ECCS-NE 5 mL，加37 ℃的純水在10 mL 容量瓶中定容，搖勻，量取3 mL，置離心管10000 r/min離心20 min，精密量取上清液1 mL，加入適量甲醇混勻，超聲助溶10 min，待其冷卻到室溫。0.22 μm微孔過濾膜濾過待檢，所得藥物含量W2，3 次平行試驗(yàn)。按已有公式得出載藥量及包封率[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 處方的選擇

2.1.1 油相的選擇

根據(jù)2015版獸藥典標(biāo)準(zhǔn)，稱取10 mL四黃止痢復(fù)方中藥溶液置于室溫下滴加在10 mL備選油相中，邊滴加邊振蕩至飽和，靜止5 min 后振蕩30 s，觀察30 min 內(nèi)溶解情況，平行測定3次結(jié)果顯示，ECCS溶液在IPM中溶解度最大。因此，選擇IPM為油相。

2.1.2 表面活性劑的選擇

聚山梨醇酯、聚氧乙烯40蓖麻油所形成的納米乳體系放置一段時(shí)間后體系渾濁。偽三元相圖法繪制吐溫80、泊洛沙姆體系的偽三元相圖。結(jié)果表明，吐溫80作為表面活性劑時(shí)成乳區(qū)域更大，因此確定吐溫80為表面活性劑。

2.1.3 助表面活性劑的選擇

聚乙二醇、1，2 丙二醇、無水乙醇、丙三醇與表面活性劑Tween 80 混合后；按照不同的質(zhì)量比與油相混合，滴加水相，均可形成納米乳體系。但無水乙醇放置后揮發(fā)體積減小、1，2丙二醇出現(xiàn)渾濁。偽三元相圖法繪制聚乙二醇、丙三醇體系的偽三元相圖，確定以丙三醇為助表面活性劑。

2.1.4 Km值的確定（見圖1）

圖1 不同Km值所繪制的偽三元相圖Fig.1 Pseudo ternary phase diagram drawn by different Km values

Km 是決定納米乳形成的重要條件[12]，分別以Km=0.5、Km=1、Km=2、Km=3，油相為IPM、表面活性劑為吐溫80、助表面活性劑為丙三醇，以“1.3.1”項(xiàng)方法繪制偽三元相圖。由圖1 可知，納米乳成乳面積為Km=2＞Km=0.5＞Km=1＞Km=3，因此篩選出Km值為2。

2.1.5 處方篩選結(jié)果

以四黃止痢復(fù)方中藥為原料藥，IPM 為油相，吐溫80為表面活性劑，丙三醇為助表面活性劑制成復(fù)方納米乳，乳液黃色澄清透明、無沉淀、無分層、性質(zhì)穩(wěn)定。油相與表面活性劑比為1∶4，Km 值為2∶1，所制備的納米乳粒子的粒徑大小等各方面均最穩(wěn)定。

2.2 含藥納米乳的制備

精確量取吐溫804 mL、丙三醇2 mL，置于50 mL燒杯中，在磁力攪拌器的作用下，37 ℃恒溫?cái)嚢?，緩慢滴? mL IPM，繼續(xù)在37 ℃的恒溫磁力攪拌器下進(jìn)行混勻，加入20 mL蒸餾水，在上述條件下繼續(xù)混勻，加入ECCS攪拌至完全溶解，得澄清透明的四黃止痢復(fù)方中藥納米乳制劑。

2.3 四黃止痢復(fù)方中藥納米乳的評價(jià)

2.3.1 外觀形態(tài)觀察及乳液類型

外觀呈透明或者半透明狀態(tài)；且有乳光；10000 r/min離心25 min，乳液穩(wěn)定無分層或絮凝現(xiàn)象；平行光照射后出現(xiàn)丁達(dá)爾現(xiàn)象，可觀察到亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度較蘇丹紅Ⅲ擴(kuò)散快，判斷ECCS-NE為O/W型。

2.3.2 粒徑分布及Zeta電位（見圖2）

圖2 納米乳透射電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 Transmission electron microscope photo of nanoemulsion

由圖2 可知，納米乳顆粒是分布均勻的圓球形且大小基本一致，ECCS-NE 的粒徑為（45.06±2.47）nm，ECCSNE的Zeta電位為-6.11 mV。

2.3.3 pH值檢測結(jié)果（見表1）

由表1可知，pH值的平均值為6.94，該制劑偏酸性。

表1 pH值檢測結(jié)果Tab.1 pH value test results

2.4 穩(wěn)定性

ECCS-NE 分別采用光照射試驗(yàn)、溫度試驗(yàn)、濕度試驗(yàn)、離心試驗(yàn)、常溫靜置，試驗(yàn)仍黃色澄清液體、無沉淀、無水油分層。

2.5 包封率和載藥量（見表2）

表2 包封率及載藥量檢測結(jié)果Tab.4 Test results of encapsulation efficiency and drug loading 單位：%

由表2 可知，該制劑的包封率為0.727，載藥量為84.8%。

3 討論

藥物的首過效應(yīng)使動(dòng)物口服藥物時(shí)效力降低，患禽用藥采取混水混飼方式時(shí)，導(dǎo)致藥物攝入量不均。因此，本試驗(yàn)將四黃止痢復(fù)方中藥制成納米乳劑，借助納米劑的控釋、緩釋可提高藥物在體內(nèi)停留時(shí)間，提高生物利用度。

油相、表面活性劑、助表面活性劑均應(yīng)選擇對本試驗(yàn)所用藥物溶解度大、無毒、無刺激，因而本試驗(yàn)選用IPM、丙三醇、吐溫80、蒸餾水為成乳系統(tǒng)。備選油相中IPM 對四黃止痢復(fù)方中藥溶解度最大；選取吐溫80作為表面活性劑時(shí)成乳區(qū)最大；助表面活性劑常選用醇類來協(xié)助調(diào)解HLB 值和增加藥物溶解度，使其形成更穩(wěn)定的納米粒子，因此選用丙三醇作為助表面活性劑。但是，醇類是揮發(fā)性的[13]。因此，必須將其密封存放，否則會引起藥物沉淀并影響納米乳劑的質(zhì)量。

4 結(jié)論

通過繪制偽三元相圖的方法來確定四黃止痢復(fù)方中藥納米乳的最適制備工藝，并對其進(jìn)行質(zhì)檢，且穩(wěn)定性良好。