張恒慧，尤建嵩，賀東亮，鄒棟良，趙肖瓊，李曉宇，李淑英，徐永平，*

（1. 太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008；2. 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116024；3. 大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連116023）

仔豬腹瀉影響畜牧業(yè)的發(fā)展，我國每年因仔豬腹瀉導(dǎo)致的死亡率約15%，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10 億元[1-2]。飼料行業(yè)使用大量的飼用抗生素防治仔豬腹瀉，導(dǎo)致一系列的細(xì)菌耐藥性、抗生素殘留等，從而影響國民健康和養(yǎng)殖業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展[3]。2020年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已全面禁止飼料中添加抗生素藥物。用于防治仔豬腹瀉的新型“抗生素替代”方案的研究和應(yīng)用已經(jīng)迫在眉睫[4-5]。仔豬腹瀉的發(fā)病機(jī)理是由于產(chǎn)腸毒素大腸桿菌依賴菌毛黏附在腸道繼而大量增殖后分泌腸毒素引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6-7]。因此，以腹瀉發(fā)生過程的兩大類抗原腸毒素和菌毛為作用靶點(diǎn)，通過疫苗產(chǎn)生相應(yīng)抗體的手段可以有效地阻斷腹瀉的發(fā)生，是替代抗生素防治仔豬腹瀉的重要潛在方案之一[8]。

本團(tuán)隊(duì)在前期的工作中將STa、STb 和LTB 3 種主要腸毒素基因重組連接，去掉腸毒素基因中編碼毒性結(jié)構(gòu)域序列，有效保留表達(dá)免疫原性的序列，通過原核表達(dá)體系構(gòu)建表達(dá)重組三價(jià)腸毒素SLS的重組菌[9]。本研究的在前期工作的基礎(chǔ)上，研發(fā)包含重組三價(jià)腸毒素抗原及主要菌毛抗原的復(fù)合多價(jià)疫苗的抗原的制備工藝條件、提高疫苗中抗原的純度以及降低抗原的制備成本，從而優(yōu)化抗原的生產(chǎn)工藝，為疫苗后續(xù)的生產(chǎn)及臨床免疫試驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

三價(jià)腸毒素STa-LTB-STb 融合重組菌BL21 由大連理工大學(xué)ABTNL 實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌F4ac 標(biāo)準(zhǔn)菌株C83902 由中國獸藥監(jiān)察所提供；大腸桿菌F5 標(biāo)準(zhǔn)菌株C83914由中國獸藥監(jiān)察所提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

改良Minca 培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；TSB 培養(yǎng)基（美國Sigma 公司）；酵母粉、蛋白胨（英國Oxoid公司）；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（南京奧生化學(xué)技術(shù)有限公司）；N-三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、氨基乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、過硫酸銨（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；TEMED（美國Amresco 公司）；尿素（ultra）（加拿大Bio Basic Inc.）；二硫蘇糖醇（DTT）（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白[寶生物（大連）有限公司]提供；硫酸卡那霉素（Kan）（浙江金華康恩貝生物制藥有限公司）。

TE1 緩沖液：10 mmol/L Tris·Cl（pH 值7.0）、1 mmol/L EDTA；TE2 緩 沖 液：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、10 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、0.5%TritonX-100；TE3 緩沖液：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、4 mol/L 尿素；包涵體溶解緩沖液A：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、10 mmol/L DTT；包涵體溶解緩沖液B：50 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EDTA（pH值8.0）、50 mmol/L NaCl。

1.3 試驗(yàn)儀器

TP600 型PCR 儀[寶生物工程（大連）有限公司]；10C型電泳儀、31D 型電泳槽、9405B 型脫色搖床（北京六一儀器廠）；PHS-3C 型精密pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器）；0.45 μm 濾膜（Φ10 cm）（上海市新亞凈化器件廠）；5804R型低溫冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf）；303-4A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器公司）；FA1004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌毛蛋白PCR鑒定

根據(jù)表達(dá)ETEC 主要菌毛抗原的基因序列，從結(jié)構(gòu)基因中選取保守序列作為目的片段，同時(shí)參考文獻(xiàn)報(bào)道，使用primer 5.0 設(shè)計(jì)F4 菌毛蛋白基因和F5 菌毛蛋白基因的PCR 引物[10]。上述引物的合成均由寶生物工程（大連）有限公司完成。不同菌毛蛋白基因PCR引物見表1。

表1 不同菌毛蛋白基因PCR引物Tab.1 PCR primers of different fimbria genes

分別將采樣的ETEC菌種和F4標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，菌懸液經(jīng)過離心和PBS洗滌后獲得菌體沉淀，再加入超純水吸混均勻，在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，迅速0 ℃冰浴5 min，4 ℃10000 r/min離心10 min，取上清，制備DNA模板[11]。采用20 μL PCR 體系，以各菌株DNA 為模板，分別采用F4菌毛蛋白和F5菌毛蛋白基因的特異性引物進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系成分見表2。

為降低非特異性擴(kuò)增，提高引物結(jié)合率，對(duì)PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體PCR反應(yīng)條件見表3。

PCR 結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳來對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。每個(gè)樣品取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×loading buffer混勻后，上樣至1.5%的瓊脂糖凝膠，在100 V恒壓下電泳40 min。以DNA Marker DL2000為參照，紫外燈下觀察擴(kuò)增片段的大小并分析結(jié)果。

1.4.2 重組三價(jià)腸毒素蛋白（SLS）的誘導(dǎo)表達(dá)、粗提和純化

將凍存的重組菌BL21 接種于含卡那霉素（Kan）濃度為25 mg/L 的LB 培養(yǎng)基在37 ℃恒溫?fù)u床中活化培養(yǎng)12 h；將活化后的種子液以2%的接種量接種于含Kan（終濃度25 mg/L）的LB 培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌懸液OD600nm為0.6左右時(shí)，根據(jù)培養(yǎng)液體積加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)菌體5 h左右，進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)[12]。將重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)完全的菌液離心收集菌體細(xì)胞，加入等體積PBS緩沖液洗滌菌體，重復(fù)操作3次后在菌體沉淀中加入原菌液體積1/50倍的TE1緩沖液，吹打均勻至沒有凝塊，在冰水浴中將菌懸液超聲破碎30 min（破碎5 s、暫停5 s），將破碎混合液冷凍離心收集沉淀，即為SLS 重組蛋白粗提物。在重組蛋白粗提物中加入TE2 緩沖液進(jìn)行洗滌純化，用移液槍吹洗均勻至沒有凝塊，在搖床上振蕩洗滌20 min，之后4 ℃、7000 r/min 離心20 min，收集沉淀；在沉淀中加入TE3 緩沖液，在搖床上振蕩洗滌20 min，隨后4 ℃、7000 r/min 離心20 min，收集純化后的重組蛋白沉淀[13]。

表2 PCR反應(yīng)體系成分Tab.2 PCR system components

表3 PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction conditions

1.4.3 重組蛋白空間（三級(jí)及以上）結(jié)構(gòu)和抗原性的恢復(fù)和方法優(yōu)化

經(jīng)過重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體的形式存在，其天然構(gòu)象被破壞，如若發(fā)揮重組腸毒素蛋白的免疫原性，需要經(jīng)過體外變性和復(fù)性處理來恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)和天然構(gòu)象。將純化后的重組蛋白沉淀重懸至包涵體溶解緩沖A液中，漩渦振蕩混合均勻，于37 ℃搖床振蕩孵育使重組蛋白顆粒變性溶解；加入3倍體積的包涵體溶解緩沖B 液，用10 mol/L KOH 調(diào)節(jié)pH 值至9.8，室溫下靜置30 min 用濃HCl 將溶液pH 值調(diào)至8.0，室溫下靜置40 min 將溶解液離心取上清，4 ℃保存待用。包涵體蛋白在含有8 mol/L 尿素的溶解緩沖A 液的作用下，分子內(nèi)氫鍵被破壞，二級(jí)以上空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而變性溶解。為恢復(fù)重組腸毒素的天然構(gòu)象，需要除去其中添加的變性劑[14]。

本試驗(yàn)分別對(duì)比研究常規(guī)透析方法以及多重優(yōu)化方法對(duì)重組蛋白復(fù)性的效果。首先根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用常規(guī)透析方法進(jìn)行重組蛋白的復(fù)性，將變性溶解的重組蛋白溶液稀釋至0.5 g/L，依次加入尿素濃度為2.0、1.0、0.5、0 mol/L 4 個(gè)梯度的透析液中，4 ℃下透析復(fù)性，每個(gè)梯度持續(xù)12 h；最后兩次透析復(fù)性液中不加甘油，最終獲取純化、復(fù)性后的重組蛋白溶液，SDS-PAGE驗(yàn)證并檢測純化、復(fù)性后重組蛋白及其純度，并用BCA法測取蛋白濃度[15]。

重組蛋白復(fù)性效果的好壞關(guān)系著重組蛋白能否有效恢復(fù)空間構(gòu)象以及蛋白的純度、濃度和得率，直接影響后續(xù)疫苗使用的效果。在常規(guī)透析方法的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，建立稀釋-透析-超濾離心多重去除尿素的方法，對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，以提高重組蛋白的純度和得率。將重組蛋白稀釋溶液依次加入尿素濃度為6、4、2、1、0 mol/L 5個(gè)梯度的透析液中，4 ℃下透析復(fù)性，前4個(gè)梯度持續(xù)12 h，最后1個(gè)梯度持續(xù)24 h，再用截留分子量為3 kDa的超濾離心管在4 ℃、5000 r/min條件下對(duì)透析液離心處理10 min，檢測重組蛋白的純度和濃度。

1.4.4 F4菌毛蛋白的表達(dá)、提取和純化

本試驗(yàn)分別采用改良Minca培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)F4+標(biāo)準(zhǔn)菌株，考察培養(yǎng)基類型的不同對(duì)菌毛表達(dá)量的影響并且優(yōu)化F4 菌毛的表達(dá)；菌毛的提取和純化采用熱振蕩法和等電點(diǎn)沉淀法，經(jīng)過提純獲得純化的F4 菌毛蛋白。將F4+標(biāo)準(zhǔn)菌株依次接種于3 種培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h 后離心收集菌體，用無菌PBS 溶液洗滌菌體，重復(fù)操作3次后將洗滌完成的菌液在60 ℃水浴中溫浴30 min，之后立即漩渦振蕩10 min，于11000 r/min 離心15 min 后取上清，用0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液即為F4菌毛粗提物[16]。用2.5%檸檬酸將菌毛粗提物調(diào)pH 值至3.92，4 ℃靜置2 h；4 ℃、11000 r/min離心30 min，棄上清，用無菌PBS溶解沉淀，重復(fù)操作3次后用SDS-PAGE檢測提取液中菌毛蛋白的含量及純度[17]。

1.4.5 F5菌毛蛋白的表達(dá)、提取和純化

采用F4菌毛蛋白優(yōu)化后的方法研究F5菌毛蛋白的表達(dá)和提取過程。菌毛蛋白純化過程中，調(diào)節(jié)F5 菌毛蛋白粗提液pH 值為9.75，再靜置離心收集沉淀，最后用無菌PBS溶解沉淀獲得F5菌毛蛋白提取液，并檢測溶液中菌毛蛋白的含量及純度[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌毛類型的PCR檢測結(jié)果（見圖1、圖2）

圖1 F4菌毛基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR with F4 gene primer

圖2 F5菌毛基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR with F5 gene primer

由圖1可知，采用F4菌毛基因引物對(duì)幾株大腸桿菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示F4+菌株在分量子約為817 bp處出現(xiàn)目的條帶，而F5+菌株卻未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明此基因?yàn)楸磉_(dá)F4 菌毛蛋白抗原的基因，且為F4 菌株獨(dú)有的特異性抗原。由圖2可知，使用F5菌毛基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示F5+菌株在480 bp處擴(kuò)增出目的條帶，F(xiàn)4+菌株未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明此基因?yàn)楸磉_(dá)F5 菌毛蛋白抗原的基因，且為F5+菌株獨(dú)有的特異性抗原。

2.2 SLS 誘導(dǎo)表達(dá)及提純的SDS-PAGE 檢測（見圖3、圖4）

由圖3 可知，對(duì)比IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)前后的全菌電泳圖譜，外源基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后重組蛋白得到大量表達(dá)，通過超聲破碎獲得的重組蛋白以非水溶性的包涵體形式存在，含量占粗提物總蛋白的39.6%；采用常規(guī)方法對(duì)粗蛋白進(jìn)行提純復(fù)性后重組蛋白水溶性增加，但是獲得的重組蛋白含量較低，經(jīng)Gel-Pro Analyzer 4.0分析復(fù)性后的蛋白溶液中目的蛋白含量僅為11.2%，提純方法有待優(yōu)化。

圖3 重組三價(jià)腸毒素蛋白SLS誘導(dǎo)表達(dá)及常規(guī)方法提純的電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of inducible expression and purification of SLS in routine method

由圖4可知，泳道6采用優(yōu)化后的提純方法，重組蛋白的純度非常高且無雜帶，Gel-Pro Analyzer 4.0分析結(jié)果為接近100%，而且同體積菌懸液中重組蛋白的得率也比常規(guī)方法有所提高。

圖4 重組三價(jià)腸毒素蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及提純的優(yōu)化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of inducible expression and purification of SLS in optimized method

2.3 F4菌毛的表達(dá)和純化（圖5～圖7、表4）

在菌毛蛋白抗原的制備過程中，菌毛蛋白的表達(dá)量是影響蛋白收率的重要因素。由圖5可知，F(xiàn)4菌毛蛋白出現(xiàn)在全菌SDS-PAGE 電泳的28.1 kDa 條帶處，經(jīng)Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件分析，在相同條件下使用改良Minca培養(yǎng)基培養(yǎng)的F4+標(biāo)準(zhǔn)菌株的F4菌毛表達(dá)量要高于LB培養(yǎng)基，計(jì)算得目的條帶的累積光密度（IOD值）在改良Minca 培養(yǎng)基全菌液中為9.44%高于LB 培養(yǎng)基中的6.61%；菌毛蛋白經(jīng)溫浴、振蕩脫落離開菌體，獲得粗蛋白溶液，電泳結(jié)果顯示，改良Minca培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體制的粗提液中菌毛蛋白含量要遠(yuǎn)高于LB培養(yǎng)基。由圖6可知，相同條件下改良Minca 培養(yǎng)基中全菌液目的蛋白含量為59.3%高于TSB 培養(yǎng)基中的48.0%，而且粗提物中菌毛蛋白的含量也更高。因此在改良Minca 培養(yǎng)基中生長的ETEC 菌株菌毛蛋白的表達(dá)量要高于LB 培養(yǎng)基和TSB 培養(yǎng)基，而且更利于菌毛蛋白的提取。

圖5 改良Minca培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基表達(dá)F4菌毛蛋白的對(duì)比效果Fig.5 Comparation of F4 proteins expressed in modified Minca broth and LB broth

圖6 改良Minca培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基表達(dá)F4菌毛蛋白的對(duì)比效果Fig.6 Comparation of F4 proteins expressed in modified Minca broth and TSB broth

經(jīng)過熱振蕩法制得的菌毛蛋白粗提液，采用等電點(diǎn)沉淀法對(duì)其進(jìn)行純化。F4 菌毛蛋白純化過程的SDS-PAGE 結(jié)果見7。

圖7 F4菌毛蛋白的純化（改良Minca培養(yǎng)基）Fig.7 Purification of F4 protein cultured in modified Minca broth

由圖7 可知，F(xiàn)4 菌毛蛋白粗提液在pH 值為等電點(diǎn)4.0 下沉淀純化后，獲得純度很高的菌毛蛋白溶液，電泳結(jié)果顯示幾乎只有目的條帶。利用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件對(duì)F4 菌毛蛋白純化前后的SDSPAGE 結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。F4 菌毛蛋白目的條帶大小約為28.1 kDa，而且目的蛋白的純度由純化前的43.0%上升至純化后的約100%，純化效果良好。

表4 Gel-Pro Analyzer 4.0對(duì)F4菌毛蛋白純化分析結(jié)果Tab.4 Analysis of purification of F4 protein with Gel-Pro Analyzer 4.0

2.4 F5菌毛的表達(dá)和純化（見圖8）

根據(jù)幾種表達(dá)菌毛培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選結(jié)果，選用改良Minca 培養(yǎng)基培養(yǎng)F5+標(biāo)準(zhǔn)菌株來制備F5 菌毛蛋白抗原。利用熱振蕩法獲得的F5 菌毛蛋白粗提液，在其等電點(diǎn)9.75 下進(jìn)行沉淀純化。由圖8a 可知，改良Minca 培養(yǎng)基中生長的F5 全菌電泳結(jié)果顯示，F(xiàn)5 菌毛蛋白的含量為20%，菌毛表達(dá)比較豐富；由圖8b 可知，等電點(diǎn)沉淀法獲得的F5 菌毛蛋白純化效果較好，制備了純度較高的F5 抗原蛋白。

圖8 改良Minca培養(yǎng)基培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)F5+菌株以及菌毛蛋白的純化Fig.8 F5+ETEC cultivated in modified Minca broth and F5 protein purified

3 討論

目前，國內(nèi)外已有的關(guān)于仔豬腹瀉疫苗大致可以分為：滅活或者減毒的全菌疫苗、菌毛蛋白單價(jià)或多價(jià)疫苗、類毒素疫苗、能夠重組表達(dá)單一或多種菌毛和腸毒素的基因工程疫苗及其他新興疫苗等[19]。無論何種類型的疫苗，其主要抗原還是菌毛和腸毒素。運(yùn)用基因工程的手段，對(duì)幾種腸毒素基因進(jìn)行改造，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得去掉腸毒素致病性并保留其免疫原性的重組腸毒素蛋白，可以作為制備多價(jià)疫苗腸毒素抗原的有效途徑[20]。再通過菌毛蛋白的高效表達(dá)、提取和純化，可以用來制備腸毒素菌毛復(fù)合疫苗的菌毛蛋白抗原。多價(jià)復(fù)合疫苗的免疫保護(hù)將針對(duì)腹瀉發(fā)生的細(xì)菌吸附和分泌毒素2個(gè)關(guān)鍵致病步驟，包含耐熱及不耐熱性腸毒素及主要菌毛類型的抗原，將探索預(yù)防不同類型ETEC致仔豬腹瀉的廣適性疫苗。

重組蛋白的表達(dá)、提取和純化是基因工程下游最關(guān)鍵的步驟，直接影響著能否獲得大量目的蛋白。以質(zhì)粒為載體、大腸桿菌為宿主細(xì)胞的原核表達(dá)體系，通常在表達(dá)載體中使用lac啟動(dòng)子，并且采用β-半乳糖苷酶的底物IPTG作為誘導(dǎo)劑，可以按照需求控制菌體的增殖和目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的平衡，通過選取合適的誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)劑用量，讓外源蛋白重組三價(jià)腸毒素得以大量的表達(dá)。外源蛋白經(jīng)重組表達(dá)后以包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，需經(jīng)破碎、離心后，再洗滌去除核酸、金屬離子等雜質(zhì)后，溶解于尿素溶液中；在尿素作用下，重組表達(dá)的包涵體沉淀氫鍵被打開，三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，溶解性增加；但是想要純化后的重組三價(jià)腸毒素具備免疫原性，需要除去尿素，恢復(fù)天然構(gòu)象。文獻(xiàn)報(bào)道采用常規(guī)透析方法可以對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化除去尿素，但是本研究前期結(jié)果表明提純效率不夠高，方法有待優(yōu)化。經(jīng)過多次方法改進(jìn)和試驗(yàn)分析，建立了稀釋-透析-超濾離心多重去除尿素的方法，并且獲得較好的重組蛋白提純效果，方便疫苗抗原的制備[21]。

一個(gè)完整的大腸桿菌抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K）[22]。大腸桿菌表面生長的菌毛就是表面抗原的一種，在不同的培養(yǎng)基條件下，菌毛的表達(dá)和生長量有所不同。本研究采用幾種大腸桿菌常用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基及改良Minca培養(yǎng)基分別對(duì)ETEC菌株進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)比相同培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)獲得的菌毛蛋白的表達(dá)量有所不同。其中改良Minca培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株菌毛的表達(dá)量最高，其他2種培養(yǎng)基獲得的菌毛表達(dá)量較差。從培養(yǎng)基配方的差異進(jìn)行分析，改良Minca培養(yǎng)基中添加錳、鎂、鐵等微量元素，這些微量元素很有可能就是促進(jìn)菌體表面菌毛蛋白表達(dá)量增加的原因。因此，在提取菌毛蛋白作為抗原的過程中，可以采用改良Minca培養(yǎng)基來培養(yǎng)菌體，以獲得表達(dá)量較大的菌毛蛋白。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的純化方法，能夠有效地提高重組三價(jià)腸毒素抗原制備過程中純度和產(chǎn)率；在制備菌毛抗原的過程中，使用改良Minca培養(yǎng)基來培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，可以促使F4和F5菌毛蛋白更高效地表達(dá)；經(jīng)恒溫振蕩、等電點(diǎn)沉淀提取純化的菌毛抗原蛋白純度較好，蛋白純度由粗蛋白的43%提高到約100%，為后續(xù)疫苗的制備和免疫效力的臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)參考。