曾學(xué)宇，陳 柱，毛 敏，陳之白，陳春雨，曹穩(wěn)瓏，李杰華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西南寧 530021)

甲狀腺癌是人體內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率增長迅速，在我國年齡小于30歲的女性中，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第一位。按照不同起源及分化差異，甲狀腺癌又分為乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中占比最高的病理類型。PTC的生物學(xué)行為較為溫和，發(fā)展緩慢，惡性程度較低，患者總體生存率較高[1]，但仍有部分因素對患者的預(yù)后造成不良影響，其中合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(cervical lymph node metastasis, CLNM)的負面效應(yīng)較為顯著。此外，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)均會導(dǎo)致患者預(yù)后變差，而CLNM在PTC的術(shù)后復(fù)發(fā)中有重要作用[2-5]。LIU等[2]研究顯示，伴有CLNM的PTC患者比不伴有CLNM者的術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著增高(31.5%vs. 5.2%)。目前，合并CLNM的多數(shù)PTC患者術(shù)中均進行廣泛頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)(lateral neck dissection, LND)。CHINN等[6]認為對于較年輕的患者(<24歲)，往往需要接受多次LND才可達到理想的頸側(cè)區(qū)復(fù)發(fā)控制率，而依據(jù)甲狀腺癌診療指南[7]，多次手術(shù)會明顯增加患者的喉頭水腫、喉返神經(jīng)損傷和術(shù)區(qū)出血壓迫氣管等并發(fā)癥的發(fā)生概率，對患者預(yù)后不利；術(shù)后絕大部分PTC患者采用口服左旋甲狀腺素鈉片，降低血清中促甲狀腺激素(TSH)水平的方法預(yù)防PTC的復(fù)發(fā)(即TSH抑制治療)。然而，現(xiàn)階段的相關(guān)研究尚未找到切實的證據(jù)證明TSH抑制治療對PTC患者(尤其是伴有CLNM等高風(fēng)險組PTC患者)具有可觀的預(yù)防復(fù)發(fā)的效果[8]。因此，探究PTC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體機制及影響因素，并尋求預(yù)防PTC術(shù)后復(fù)發(fā)的新方法，逐漸成為甲狀腺癌領(lǐng)域研究的一個新熱點。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白8A(bone morphogenetic protein 8A, BMP8A)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)基因家族中的一員。BMP家族在胚胎發(fā)生、骨骼形成、造血和神經(jīng)發(fā)生等過程中均發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)BMP8A的編碼產(chǎn)物可能在生殖系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮作用[9]，除此之外目前與BMP8A相關(guān)的研究不多，也尚未明確BMP8A與PTC之間的相關(guān)性。本研究通過TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫分析并獲得在 PTC中BMP8A表達差異較顯著，進一步檢測PTC與癌旁組織中BMP8A的mRNA及蛋白表達，并分析其表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，為探究針對有高復(fù)發(fā)風(fēng)險的PTC患者術(shù)后治療方案的制訂提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)收集和分析從TCGA的網(wǎng)站(https://cancergenome.nih.gov/)下載493例PTC組織和58例正常甲狀腺組織的FPKM RNA-seq數(shù)據(jù)和與之匹配的臨床資料；再根據(jù)從ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)下載得到的GRCh38.98基因組文件，將ENSEMBL ID轉(zhuǎn)換為基因符號，提取BMP8A表達的文件，用獨立t檢驗確定PTC組織與正常甲狀腺組織之間的差異表達。

從Gene Expression Omnibus(GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE64912、GSE83520、GSE33630及GSE3678共4個表達譜，通過GEO query的R軟件包驗證結(jié)果，GSE64912包括18例原發(fā)性PTC和4例非腫瘤組織，GSE83520包括12例原發(fā)性PTC和12例非腫瘤組織，GSE33630包括49例原發(fā)性PTC和54例非腫瘤組織，GSE3678包括7例原發(fā)性PTC和7例非腫瘤組織，同樣采用獨立樣本t檢驗分析BMP8A在PTC組織與正常甲狀腺組織之間的表達差異。

1.2 患者臨床信息及組織標(biāo)本收集2019年4月至2019年10月期間，收集于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科接受手術(shù)治療的PTC患者標(biāo)本及與其癌旁組織，共35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者病理結(jié)果證實為PTC；術(shù)前未行甲狀腺放化療或內(nèi)分泌治療；均行甲狀腺癌根治術(shù)；臨床病歷及病理資料完整。

于術(shù)中收集35例患者切除的PTC組織及癌旁組織(距離腫瘤組織≥3 cm)，新鮮標(biāo)本獲取后分別放置于裝有RNA保護劑的普通凍存管中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

同時收集患者性別、年齡、腫瘤大小及有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床信息。

上述患者均知曉且已簽署知情同意書，相關(guān)研究均經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 Real-time PCR檢測PTC中BMP8A的mRNA表達用9767試劑盒分別提取PTC組織及其癌癥組織的總RNA；RR036A試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用RR820A試劑盒配制Real-time PCR體系、ABI 7500系統(tǒng)進行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火34 s，共循環(huán)40次；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s結(jié)束，讀取并記錄每個樣本的Ct值，計算并比較癌組織與癌旁組織ΔCt分析BMP8A的表達差異。反應(yīng)體系的體積為20 μL，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。上述試劑盒均系TaKaRa公司產(chǎn)品，引物的設(shè)計與合成由南寧科迪生物技術(shù)有限公司提供，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR中各基因的引物序列

1.4 Western blotting檢測BMP8A蛋白的表達用含10 g/L PMSF的RIPA試劑提取總蛋白質(zhì)，并使用BCA法測定濃度并依據(jù)所測蛋白濃度調(diào)整上樣體積；SDS-PAGE(100 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠)80 V、120 V恒壓電泳；200 mA恒流1.5 h濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至0.45 μm的PVDF膜上；使用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，于兔抗人BMP8A(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后，轉(zhuǎn)至HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)的二抗溶液中室溫孵育1 h，TBST洗滌后超敏ECL試劑顯影。實驗結(jié)果用ImageJ軟件進行分析(上述試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，所用抗體來自Immunoway公司，抗體編號分別為Q7Z5Y6和P04406)。

2 結(jié) 果

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果將TCGA數(shù)據(jù)庫中的PTC數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，PTC組織中BMP8AmRNA較正常組織呈低表達(P<0.001，圖1A)。同時在不伴有CLNM的PTC組織中，mRNA表達高于伴有CLNM組(P=0.046 5，圖1B)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌組織或正常組織中BMP8A的mRNA相對表達

為進一步驗證從TCGA數(shù)據(jù)分析所獲得的結(jié)論真實性，分別將GEO數(shù)據(jù)庫中的獨立數(shù)據(jù)集GSE64912、GSE83520、GSE33630和GSE3678進行t檢驗和配對t檢驗分析，獲得了與TCGA數(shù)據(jù)庫分析一致的結(jié)果：BMP8AmRNA在PTC組織中相較于正常甲狀腺組織為低表達(均P<0.05，圖2)。因此，不同數(shù)據(jù)庫之間的獨立數(shù)據(jù)集分析得到相互驗證。

圖2 在不同GSE數(shù)據(jù)集中PTC組織及甲狀腺正常組織的BMP8A mRNA相對表達

2.2 PTC及癌旁組織中BMP8A mRNA的表達Real-time PCR結(jié)果顯示，BMP8A和β-actin的溶解曲線皆單峰，峰值溫度分別為86.64 ℃和87.72 ℃，說明未產(chǎn)生引物二聚體，引物特異性良好。兩者擴增曲線均可見明顯平臺期，Ct值波動幅度小，實驗數(shù)據(jù)可靠。PTC組織中BMP8A的ΔCt(8.779±1.733)高于癌旁組織(6.829±1.688)，即BMP8A在PTC組織中呈低表達(P<0.001，圖3)。

2.3 PTC中BMP8A的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系在不同患者PTC組織中BMP8A的ΔCt值與患者臨床病理特征的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在PTC組織中BMP8A的表達與有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

圖3 PTC組織與癌旁組織中BMP8A的ΔCt比較

2.4 PTC及癌旁組織中BMP8A的蛋白表達Western blotting結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，BMP8A蛋白在 PTC組織中呈低表達(t=-4.044,P=0.003)；同時，伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織(N1)BM8PA蛋白表達明顯低于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織(N0)(t=-9.623,P<0.001，圖4)。

表2 BMP8A mRNA表達與 PTC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖4 Western blotting檢測BMP8A蛋白表達及統(tǒng)計學(xué)分析

3 討 論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率不斷增加，發(fā)病日益年輕化。PTC在甲狀腺癌中占比最高，其疾病進程總體較緩慢，患者大都預(yù)后良好，10年生存率達93%，30年生存率可達76%，然而PTC的復(fù)發(fā)率不低，約20%的患者會面臨行二次手術(shù)或多次手術(shù)的風(fēng)險[10]。諸多回顧性分析都已闡明，CLNM對PTC的復(fù)發(fā)有顯著影響[11-12]，而當(dāng)前PTC的CLNM發(fā)生機制及其潛在影響因素尚未明確。LU等[13]曾通過整合生物信息學(xué)篩選出了數(shù)個與甲狀腺癌相關(guān)的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，并預(yù)測這些DEGs可能通過細胞外基質(zhì)受體的相互作用、PI3K-AKT信號通路和局灶性黏附等途徑促進CLNM的發(fā)生。本研究亦通過對兩個數(shù)據(jù)庫(TCGA、GEO)進行分析，發(fā)掘出另一個與PTC相關(guān)的差異表達基因BMP8A。

BMP8A屬于BMP家族，該基因家族可以編碼TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)蛋白質(zhì)超家族的分泌配體，這些配體與多種TGF-β受體結(jié)合，使SMAD基因家族的轉(zhuǎn)錄因子被募集和激活，從而調(diào)節(jié)機體的基因表達；該家族還是多能分子，可協(xié)調(diào)從早期胚胎和出生后發(fā)育到組織修復(fù)、再生和機體穩(wěn)態(tài)等多種細胞功能。此外，BMP中不少成員也與腫瘤相關(guān)。LI等[14]研究顯示，BMP4的上調(diào)使肝癌細胞遷移、侵襲和通道樣結(jié)構(gòu)形成的能力增強，促進上皮-間充質(zhì)過程的轉(zhuǎn)化和干細胞相關(guān)蛋白OCT4和SOX2的表達。此外，BMP4的過表達也能有效提高血管生成擬態(tài)相關(guān)蛋白的活性，最終增強肝細胞癌的血管侵襲性。SUN等[15]發(fā)現(xiàn)，BMP4可通過介導(dǎo)Smad1/5/9磷酸化和Smad4表達，引起SOX2的下調(diào)從而對多組膠質(zhì)母細胞瘤的培養(yǎng)細胞發(fā)揮生長抑制作用。WANG等[16]發(fā)現(xiàn)，BMP2的高表達可能會激活A(yù)KT/mTOR通路，促進乳腺癌的微鈣化灶形成，進而對靶向治療或內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗力，預(yù)示不良預(yù)后。MIURA等[17]的實驗表明，在胸腺上皮瘤中BMP7的高表達與預(yù)后不良密切相關(guān)，其可能成為胸腺上皮瘤的一個新的預(yù)后生物標(biāo)志物。YU等[18]的研究提示，BMP8A可以通過促進Nrf2磷酸化及激活TRIM24而增強腎透明細胞癌的生存和耐藥性。以上研究表明，BMP家族廣泛參與腫瘤的發(fā)展進程，然而目前有關(guān)BMP家族與甲狀腺癌的研究報道尚不多。

BMP8A作為BMP家族中的重要一員，依據(jù)NCBI(The National Center for Biotechnology Information)的數(shù)據(jù)，其在正常甲狀腺組織中的表達顯著高于其他器官組織。MATSUMOTO等[19]通過基因芯片篩選并證實了包括BMP8A在內(nèi)的數(shù)個基因參與了T3型Graves病的發(fā)病。CHEN等[20-21]的研究表明，Graves病患者有較高的PTC發(fā)病風(fēng)險，而PTC在伴有Graves病的患者群體中則表現(xiàn)出更高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。這提示BMP8A與PTC之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。而本研究首先通過生物信息學(xué)挖掘和分析，初步揭示BMP8A與PTC之間的相關(guān)性；為進一步驗證結(jié)論，先后采用了Real-time PCR和Western blotting技術(shù)檢測BMP8A的表達，結(jié)果顯示，BMP8A在PTC組織中的表達顯著低于癌旁組織，而伴有CLNM患者的PTC組織中BMP8A表達也明顯低于不伴有CLNM患者，據(jù)此初步推斷BMP8A可能是PTC的抑癌基因。但需要指出的是，LIU等[22]也開展了BMP8A與PTC的相關(guān)實驗和研究，其結(jié)論與本研究相反，或許后續(xù)仍需要加大樣本、重復(fù)試驗加以驗證。

綜上所述，本研究認為BMP8A在PTC組織中存在顯著的表達差異，相較于癌旁組織呈低表達，且其表達與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達降低更明顯。這提示BMP8A的表達上調(diào)可能會對PTC細胞的增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一定抑制作用。由于頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTC的術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，BMP8A有望成為一個新生物靶點，為PTC的診斷、治療和預(yù)防復(fù)發(fā)提供新的方向。但本研究仍有不足之處，關(guān)于BMP8A在PTC細胞中的表達調(diào)控、作用通路等具體生物學(xué)機制尚待進一步研究。