孫亞娥，焦安君，王 昕，張星哲，雷 蕾，楊小豐，解 濤，周曉勃，史 霖，張保軍,4,5，劉曉斌

(1. 延安大學醫(yī)學院，陜西延安 716000；2.西安交通大學基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，陜西西安 710061；3.西安交通大學醫(yī)學部轉化醫(yī)學研究院感染與免疫研究所，陜西西安 710061；4.環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室(西安交通大學)，陜西西安 710061；5. 西安市免疫相關疾病重點實驗室，陜西西安 710061)

芳基烴受體核傳送器樣分子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like, Arntl)也稱為BMAL1、MOP3、BMAL1c、JAP3、PASD3、TIC、bHLHe5，其編碼基因位于小鼠7號染色體上，是外周時鐘核心基因，也是目前唯一發(fā)現的單獨敲除會導致小鼠活動節(jié)律性失調的基因[1]。哺乳動物的免疫活動也呈現節(jié)律振蕩[2]，但在免疫細胞中，Arntl的作用不僅是調節(jié)節(jié)律，還影響到免疫細胞的發(fā)育和功能。髓系祖細胞缺失Arntl會促使其向IL-17+/IFN-γ+T細胞分化，引起中樞神經性自身免疫性疾病(EAE)的惡化[3]；小鼠缺失Arntl(Arntl-/-)會使外周血和脾臟中的B細胞數目減少，導致pre-B細胞不能分化為成熟的B細胞[4]；巨噬細胞缺失Arntl則會增加其運動性及吞噬功能，使其能更好地抵抗肺炎球菌引起的感染[5]。本研究團隊通過Immgen數據庫檢索發(fā)現，Arntl在小鼠DP細胞中表達較高，提示其在T細胞此階段的分化發(fā)育中可能發(fā)揮作用，但目前沒有相關研究報道。因此，本研究擬采用T細胞特異性敲除Arntl的小鼠模型(ArntlF/FCD4cre+小鼠)研究Arntl對T細胞的發(fā)育及抗感染免疫應答的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物ArntlF/F小鼠和CD4cre+小鼠均購自Jackson。ArntlF/FCD4cre+小鼠和ArntlF/FCD4cre-小鼠的飼養(yǎng)和繁殖均在西安交通大學醫(yī)學部SPF級動物房〔許可證:SYXK(陜)2020-005〕，動物實驗均符合西安交通大學醫(yī)學部實驗動物倫理指南。

1.1.2實驗試劑抗體CD4-APC/CY7(clone:GK1.5)、CD8-FITC(clone:53-6.7)、CD44-PE/CY7(clone:IM7)、CD62L-APC(clone:MEL-14)、TCRγδ-PE/CY7(clone:GL3)、CD25-PE(clone:PC61)、FOXP3-APC(clone:MF-14)、IFNγ-PE/CY7(clone:XMG1.1)、Purified anti-mouse CD3ε Antibody(clone:145-2C11)、Purified anti-mouse CD28 Antibody(clone:37.51)、Purified anti-mouse IL-4 Antibody(clone:11B11)和試劑Recombinant Mouse IL-2(Cat:575402)、Recombinant Mouse IL-12(Cat:577002)、Monensin(Cat:420701)、Brefeldin A(Cat:420601)、細胞破膜劑(Cat:420801)、清洗劑(Cat:421002)均購自BioLegend。GP33和CD1d tetramer由NIH Tetramer Core Facility提供。PDBU(Cat:524390)和Ionomycin(Cat:I3909)購自Sigma-Aldrich。CountBrightTMabsolute counting beads(Cat:C36950)購自invitrogen。RNA提取試劑盒(Cat:DP419)購自天根生物。反轉錄試劑盒(Code No.FSQ-301)購自東洋紡。

1.1.3實驗儀器流式細胞儀(型號：CytoFLEX，BECKMAN)；PCR儀(型號：BIORAD，Thermal Cycler)；RT-PCR儀購(型號：StepOnePlus，Applied Biosystems)；離心機(型號：centrifuge 5810R, Eppendorf)。

1.2 實驗方法

1.2.1條件性敲除小鼠的構建及鑒定將ArntlF/F小鼠和CD4cre轉基因小鼠(CD4cre+小鼠)進行兩代雜交，獲得對照組小鼠(ArntlF/FCD4cre-, WT)和基因敲除組小鼠(ArntlF/FCD4cre+, KO)?；蛐丸b定采用PCR擴增法，引物序列CD4cre：Forward 5′-GGGTGCCCACTTTTGTGTAT-3′，Reverse 5′-ATGTTTAGCTGGCCCAAATG-3′；Arntl：Forward

5′-ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG-3′，Reverse 5′-CTGACCAACTTGCTAACAATTA-3′。樣本為小鼠腳趾組織，提取DNA后，通過PCR擴增目的基因片段，經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀掃描分析。

1.2.2實驗分組6～10周齡的小鼠，基因型ArntlF/FCD4cre-的小鼠為對照組(WT)，基因型ArntlF/FCD4cre+的小鼠為基因敲除組(KO)。每次實驗取每組小鼠3～5只。

1.2.3病毒感染方法取-80 ℃存放的LCMV病毒，于37 ℃水浴中快速解凍，每只小鼠以2×105PFU劑量腹腔注射。在感染后第8天，分析脾臟中淋巴細胞的比例及表型。

1.2.4胸腺和脾臟中淋巴細胞的提取分別取WT(n=3)和KO(n=3)組小鼠的胸腺及脾臟，研磨，200目篩網過濾，1 500 r/min、4 ℃離心5 min。棄上清，加入1 mL紅細胞裂解液重懸細胞，作用1 min后加FACS(1×PBS+2% FBS)洗滌2次，用1 mL FACS重懸，備流式檢測。

1.2.5流式細胞術檢測細胞的數目和比例取1.2.4項備好的淋巴細胞，按體積1∶400的比例加入特定組合抗體，冰上避光孵育30 min，用FACS緩沖液清洗1次后，每管加2 μL CountBrightTMabsolute counting beads，流式細胞術檢測各類細胞的數目和比例。

1.2.6胞內細胞因子檢測取WT(n=3)和KO(n=3)組的小鼠脾臟淋巴細胞，按每孔2×105的細胞密度接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，加入Monensin(2 μmol/L)、Brefeldin A(5 μg/mL)、Ionomycin(0.5 μg/mL)、PDBU(1 μmol/L)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)4 h后，收集細胞，用FACS洗滌。進行細胞表面標志抗原染色，然后進行胞內細胞因子染色(具體方法詳見BioLegend相關試劑說明書)，最后用流式細胞儀進行檢測。

1.2.7Th細胞的體外誘導分化用流式分選儀分選源自WT(n=3)和KO(n=3)小鼠的初始CD4+T細胞(CD4+CD25-CD44-CD62L+T細胞)，按每孔1×105的細胞密度接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板預先低包被anti-CD3(5 μg/mL)、anti-28(2.5 μg/mL)，培養(yǎng)基中加入IL-2(2.5 ng/mL)、IL-12(20 ng/mL)、anti-IL-4(10 μg/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)96 h。在培養(yǎng)的第92 h，每孔加入Monensin(2 μmol/L)、Brefeldin A(5 μg/mL)、Ionomycin(0.5 μg/mL)、PDBU(1 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細胞，用FACS清洗1次后染色。先進行表面標志抗原染色，再進行胞內細胞因子IFN-γ染色(步驟同前)，用流式細胞儀檢測。

1.2.8qPCR檢測LCMV病毒載量取LCMV感染后第8天的脾臟細胞，用總RNA提取試劑盒提取RNA，用等量的RNA進行反轉錄，qPCR檢測LCMV病毒載量，引物序列：Forward 5′-TGCCTGACCAAATGGATGATT-3′，Reverse 5′-CTGCTGTGTTCCCGAAACACT-3′。以actin作為內參照，計算病毒的相對載量。

2 結 果

2.1 T細胞中特異性敲除Arntl小鼠的鑒定Arntl+/+的PCR產物大小為327 bp，ArntlF/+的PCR產物大小為327 bp和431 bp，ArntlF/F的PCR產物大小為431 bp(圖1A)。CD4cre+的PCR產物大小為450 bp，CD4cre-的PCR擴增條帶則是陰性(圖1B)。對各型小鼠PCR結果顯示：T細胞中特異性敲除Arntl基因的小鼠構建成功。

2.2 Arntl敲除對T細胞發(fā)育的影響WT小鼠(ArntlF/FCD4cre-)和KO小鼠(ArntlF/FCD4cre+)胸腺中DP、CD4+、CD8+、Treg(CD4+CD25+FOXP3+)、γδT(TCRγδ+)、NKT(CD1d+TCRβ+)等主要T細胞亞群的比例和數目無統(tǒng)計學差異(圖2)；脾臟中CD4+、CD8+、Treg、γδT、NKT等主要T細胞亞群的比例和數目也未見統(tǒng)計學差異(圖3)。

2.3 Arntl敲除對LCMV感染后小鼠脾臟中T細胞的影響LCMV感染后，WT和KO組小鼠脾臟中CD4+T細胞、CD8+T細胞占總細胞比例及病毒特異性GP33+T細胞占CD8+T細胞的比例無統(tǒng)計學差異；CD8+的效應T細胞(CD8+CD44+CD62L-)和GP33+的效應T細胞(CD8+GP33+CD44+CD62L-)的比例也無統(tǒng)計學差異(圖4)。

2.4 Arntl敲除對脾臟中病毒載量的影響用qPCR的方法檢測脾臟中LCMV病毒載量，結果顯示，KO組LCMV的相對表達量較WT組顯著降低(P<0.05，圖5)。說明KO小鼠脾臟中的病毒含量較少，KO小鼠對病毒的清除能力較強。

2.5 Arntl敲除對LCMV感染后小鼠脾臟中T細胞分泌IFN-γ的影響為了研究Arntl敲除鼠中病毒載量降低是否與T細胞的功能增強有關，本研究分析了LCMV感染后脾臟中CD8+T細胞和GP33+T細胞分泌炎性因子IFN-γ的情況。結果顯示，KO組小鼠中CD8+IFN-γ+T細胞占總CD8+T細胞的比例較WT組顯著升高，GP33+IFN-γ+T細胞的比例占總GP33+T細胞的比例也顯著升高(P<0.01，圖6A～6D)。

圖2 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠胸腺中各T細胞亞群的比例和數目

2.6 Arntl敲除促進初始CD4+T細胞向Th1細胞分化為了探索Arntl在T細胞免疫應答過程中對CD4+T細胞分化的影響，本研究分別分選了WT和KO組小鼠淋巴結中的初始 CD4+T細胞(CD4+CD25-CD44-CD62L+)，體外誘導Th1細胞分化。結果顯示，與WT組小鼠相比，KO組小鼠的初始CD4+T細胞分化為Th1細胞的比例顯著升高(P<0.01，圖6F)。

3 討 論

Arntl屬于分子時鐘基因，控制細胞生理活動的晝夜節(jié)律變化，其表達水平也隨著晝夜發(fā)生周期性的變化。在T細胞發(fā)育中，Arntl在DP階段有較高的表達，但其表達沒有明顯的節(jié)律性[6]。T細胞中Arntl的表達對T細胞的發(fā)育和功能的影響不太清楚。T細胞良好的發(fā)育是機體免疫功能的保障，T細胞數量的減少或者比例的變化與疾病的發(fā)生息息相關[7-10]。本實驗中，T細胞特異性缺乏Arntl表達并沒有引起胸腺、脾臟中主要T細胞亞群數目的改變，包括DP細胞及發(fā)揮效應功能的CD4+、CD8+T細胞和發(fā)揮調節(jié)功能的Treg細胞，因此Arntl不影響T細胞發(fā)育。本研究結果與HEMMERS[6]報道的一致。

圖3 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠脾臟中各T細胞亞群的比例和數目

T細胞在機體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。CD4+T細胞活化后，輔助調節(jié)CD8+T細胞、B細胞及天然免疫細胞的功能。CD8+T細胞通過分泌TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等來發(fā)揮效應功能，其功能的升高有利于機體抵抗病原感染和腫瘤發(fā)生[11-14]。本研究用LCMV感染對照組(ArntlF/FCD4cre-)和敲除組(ArntlF/FCD4cre+)小鼠，并檢測病毒載量，發(fā)現敲除組小鼠的病毒載量明顯降低，提示敲除Arntl增強T細胞的抗病毒功能。進一步通過流式細胞術檢測，發(fā)現CD8+IFN-γ+T細胞的比例占總CD8+T細胞的比例顯著升高，病毒特異性GP33+T細胞中分泌IFN-γ細胞的比例也顯著升高。這些結果表明，Arntl敲除后，T細胞在發(fā)生免疫應答的過程中效應功能增強。Arntl對IFN-γ的影響是否意味著其在Th細胞的分化過程中會促使Th1型細胞的分化呢？體外誘導Th1細胞分化的實驗證實了分泌IFN-γ細胞的比例增加。因此，本研究認為Arntl敲除一方面促進了Th0向Th1分化，輔助CD8+T細胞的效應功能；另一方面，Arntl敲除可以促使CD8+T細胞分泌IFN-γ，增強抗病毒免疫反應。因此，IFN-γ的表達增高可能是敲除鼠病毒清除效率增高的原因。

圖5 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠脾臟中病毒載量測定

圖6 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠T細胞分泌IFN-γ的比例變化

在固有免疫細胞中，Arntl似乎是抑制炎性反應的因子[15-16]，但Arntl如何調控IFN-γ的表達尚無研究報道。在本研究中，敲除鼠(ArntlF/FCD4cre+)T細胞分泌IFN-γ顯著增高，其具體機制需后續(xù)研究闡明。值得注意的是，本研究與HEMMERS[6]用了相似的病毒感染動物模型，但是他們的研究沒有發(fā)現Arntl對CD8+T細胞產生IFN-γ的影響，這可能是因為兩個研究對T細胞的處理是不同的。本實驗在體外采用PDBU和Ionomycin刺激T細胞4 h后檢測，而他們采用病毒抗原刺激。

綜上所述，T細胞中特異性敲除Arntl基因不影響T細胞的發(fā)育，但在發(fā)生免疫應答的過程中，通過促進Th1細胞的分化及CD8+T細胞IFN-γ的分泌而增強機體抗病毒能力。