毛建梅，周孟杰，蔡 燕

1.川北醫(yī)學院臨床檢驗醫(yī)學系,四川南充 637007；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院產前診斷中心,四川南充 637000

鮑曼不動桿菌是導致醫(yī)院內感染的常見革蘭陰性桿菌，其感染多發(fā)于重癥監(jiān)護室和神經外科，以下呼吸道分泌物檢出率最高。有研究報道，多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CR-AB)的檢出率超過60.00%，并且全耐藥鮑曼不動桿菌(PDR-AB)檢出率達16.67%[1]。隨著經驗性抗菌藥物的使用，MDR-AB對臨床上常用的抗菌藥物，如青霉素類、β-內酰胺類、碳青霉烯類、喹諾酮類藥物的耐藥率為90.00%以上，對易導致不良反應的氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率為54.50%[2]。近年來，隨著人們在中藥抗菌方面的研究不斷深入，具有抗菌活性的中藥逐漸被報道，比如魚腥草的活性成分魚腥草素鈉(SH)已被證實對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及結核分枝桿菌都有一定的抗菌作用，并且能增強阿奇霉素、氟康唑、紅霉素的抗菌活性[3-7]。本課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，SH對MDR-AB有一定的抑制作用，因此，本研究將在體外探討SH與阿米卡星(AMK)是否具有聯(lián)合抗菌作用，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本實驗所采用的10株MDR-AB菌株收集于川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院微生物室，其中6株來源于神經外科，4株來源于重癥監(jiān)護室，均為痰液標本。

1.2儀器與試劑 儀器：VITEK2全自動微生物分析儀及AST-GN鑒定卡(法國生物梅里埃有限公司)，AST-GN16藥敏卡及配套藥敏紙片，臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫(yī)療)，DHP420電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶永恒實驗儀器廠)，TECAN全波長全自動酶標儀(型號M200PR0)。試劑及藥品：SH(10克/瓶，購自西安開來生物工程有限公司)，AMK注射液(0.2克/支，川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥房提供)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，廣州賽國生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，成都市科龍化工試劑廠)。培養(yǎng)基：水解酪蛋白(MH)肉湯培養(yǎng)基(海博生物技術有限公司),MH瓊脂培養(yǎng)基(海博生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株篩選 采用VITEK2全自動微生物分析儀及AST-GN鑒定卡進行細菌鑒定，采用AST-GN16藥敏卡及配套藥敏紙片進行藥敏試驗。根據上述鑒定結果選擇10株對3類及以上抗菌藥物(包括AMK、環(huán)丙沙星、亞胺培南、青霉素、頭孢他啶等)耐藥的鮑曼不動桿菌。以ATCC19606作為質控菌株。

1.3.2細菌復蘇及菌液稀釋 將收集的10株MDR-AB菌株用30%甘油保存于-80 ℃冰箱中。實驗時取2 μL保存菌液接種于1 mL滅菌的MH肉湯培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜。次日觀察到MH肉湯培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后，8 000 r/min離心3 min后倒掉上清液，加入1 mL的生理鹽水重懸細菌，用生理鹽水將菌液調成570 nm處吸光度值(A值)為1.0 (相當于0.5麥氏濁度，1×108cfu/mL)后再稀釋1 000倍備用。

1.3.3單用SH、AMK的最低抑菌濃度(MIC)值測定 (1)微量肉湯稀釋法：稱取SH粉末，用MH肉湯配制為不同水平的SH溶液(4 500、4 000、3 500、3 000、2 500、2 000、1 500、1 000、500 μg/mL)，各取80 μL依次加入96孔板中。AMK原液100 mg/mL，用MH肉湯配制為不同水平的AMK溶液(81 920、40 960、20 480、10 240、5 120、2 560、1 280、640 μg/mL)，各取10 μL依次加入96孔板中。各對應孔中加入10 μL菌液，用MH補足至100 μL。每個水平梯度均做3個孔，同時設置藥物對照孔(不加細菌)、陽性對照孔(不加藥物)、陰性對照孔(只加MH培養(yǎng)基)。接種完后將96孔板置于37 ℃臺式恒溫振蕩器中培養(yǎng)8 h后觀察細菌生長情況，當陽性對照孔細菌生長且藥物對照孔和陰性對照孔均無菌生長時，每孔加入10 μL的MTT(用無菌磷酸鹽緩沖液配制，水平為5 mg/mL)，再次置于37 ℃臺式恒溫振蕩器中培養(yǎng)1 h，肉眼觀察培養(yǎng)孔中的顏色，黑色代表孔內有菌落，以無細菌生長的最低濃度作為該藥物的MIC值。接著每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩搖勻10 min，用酶標儀檢測490 nm處的A值并計算出各水平梯度的平均抑制率。(2)瓊脂稀釋法：SH瓊脂平板的終水平同微量肉湯稀釋法一致，取9支無菌試管，分別稱取SH粉末溶于10 mL滅菌MH瓊脂中，混勻并倒置平板冷卻備用。取9支無菌試管依次加入AMK原液(100 mg/mL)1 638.4、819.2、409.6、204.8、102.4、51.2、25.6、12.8、6.4 μL，用滅菌MH瓊脂補齊至10 mL，混勻后倒置平板備用。取2 μL稀釋好的菌液依次點種于各瓊脂平板上，每株菌在各平板上接種2個點，37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后觀察細菌生長情況，并在菌落中滴加5 μL的MTT以讀取該藥物的MIC值。所有實驗均重復3次。

1.3.4SH與AMK聯(lián)用的MIC值測定 (1)微量肉湯稀釋法：根據單藥測得的MIC值，SH以2倍MIC、AMK以1倍MIC為最高濃度，分別按倍比稀釋配制6個系列水平。取無菌的96孔板，按棋盤法設計將藥物兩兩組合加入各孔中(SH 80 μL、AMK 10 μL)，再加入10 μL菌液，并用MH肉湯補足至100 μL。(2)瓊脂稀釋法：根據單藥的MIC值，SH水平梯度設為MIC、1/2MIC、1/4MIC、0,AMK水平梯度設為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、0，分別配制兩種藥物各水平組合共28個瓊脂平板。其余操作方法同1.3.3，所有實驗均重復3次。分別記錄最佳組合效應時兩種藥物聯(lián)用時各自的MIC值及兩種藥物單用時的MIC值。計算出部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)=MICSH聯(lián)合/MICSH單用+MICAMK聯(lián)合/MICAMK單用。判讀標準：FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.52.0為拮抗作用[8]。

2 結 果

2.1單用SH、AMK的MIC值 微量肉湯稀釋法：10株MDR-AB及質控菌株單用SH的MIC值為1 200～2 800 μg/mL，單用AMK的MIC值為8 192 μg/mL。瓊脂稀釋法：10株MDR-AB及質控菌株單用SH的MIC值為2 400 μg/mL，單用AMK的MIC值為16 384 μg/mL。見表1。

2.2SH與AMK聯(lián)用的MIC值 結果顯示，SH與AMK聯(lián)用后AMK的MIC值降低至單用時的1/2，F(xiàn)ICI值均處于>0.5～1.0，表現(xiàn)出“相加”的抗菌作用。見表1。當SH(MIC)單用時無細菌生長，與AMK聯(lián)用時可見細菌生長，表明SH與AMK聯(lián)用后可能存在促進細菌生長的作用。見圖1、2。此外，根據酶標儀所測得SH(1/2 MIC)與AMK系列水平聯(lián)用后的A值計算出10株菌的平均抑制率，結果顯示，與單用AMK相比，SH與AMK(<1 024 μg/mL)聯(lián)用時的抑制率降低，SH與AMK(≥1 024 μg/mL)聯(lián)用時抑制率升高，且兩者的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 SH、AMK單用及聯(lián)用時檢測MDR-AB的MIC值和FICI值

注：黑色代表有菌落生長。

注：A、B、C、D、E、F、G均未見細菌生長，G為最佳抑菌濃度組合，F(xiàn)ICI=1/2+1/2=1。

表2 不同水平AMK單用及與SH(1/2 MIC)聯(lián)用時的平均抑制率比較

3 討 論

鮑曼不動桿菌是導致醫(yī)院內感染的主要革蘭陰性桿菌之一，可能與患者住院時間長、接受侵入性操作及使用廣譜抗菌藥物有關。有關共識指出，針對MDR-AB感染可選用頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、碳青霉烯類抗菌藥物,同時聯(lián)合氨基糖苷類或喹諾酮類抗菌藥物進行治療[9]。隨著MDR-AB、CR-AB的檢出率逐漸升高，且對常用抗菌藥物呈高度耐藥性，多種藥物的聯(lián)用為鮑曼不動桿菌的治療提供了新方案。AMK作為一種新型半合成氨基糖苷類抗菌藥物，常用于鮑曼不動桿菌的治療，當與其他抗菌藥物，如替加環(huán)素、頭孢哌酮鈉/舒巴坦聯(lián)用后的治療效果更佳[2,10]。

近年來，相關研究發(fā)現(xiàn)SH對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等都具有一定的抑菌作用[5-7]，但對鮑曼不動桿菌是否具有抑菌作用少有報道。本研究中10株MDR-AB對SH的MIC值為1 200～2 800 μg/mL，表明SH能夠在體外抑制MDR-AB，但是其單獨使用的抗菌活性相對較低。MDR-AB對AMK也表現(xiàn)出較高的耐藥性，與KUTI等[11]報道的結果一致，可見單用AMK對MDR-AB的治療效果欠佳。因此，本研究進一步探討SH能否增強AMK的抗菌作用，實驗結果表明，當SH與AMK聯(lián)用后表現(xiàn)出“相加”的抗菌作用。值得注意的是，從表2中可見SH與AMK(<1 024 μg/mL)聯(lián)用時的抑制率低于單用AMK，表明兩種藥物聯(lián)用后可能存在促進細菌生長的作用，導致上述現(xiàn)象的原因值得進一步探討。

鮑曼不動桿菌對AMK的耐藥機制包含以下幾點：(1)鮑曼不動桿菌產生氨基糖苷類修飾酶(AMEs)，編碼的相關基因大多位于質粒轉座子上，導致耐藥基因在細菌間傳播，并通過上述酶修飾、改變氨基糖苷類抗菌藥物的活性，此為最主要的耐藥機制；(2)產生16S rRNA甲基化酶，能夠使細菌的30S rRNA亞單位上的16S rRNA位點甲基化，從而改變氨基糖苷類抗菌藥物的作用靶點；(3)外排泵作用，通過促進藥物外排來降低細胞內氨基糖苷類抗菌藥物的濃度；(4)影響細菌細胞膜，即通過減少脂多糖所帶的負電荷和下調孔蛋白的表達來阻止藥物進入細胞[12]。目前報道SH主要是通過抑制細菌生物被膜的形成來達到抗菌作用[3-4]，但是較少見AMK影響細菌生物被膜的相關報道。AMK因使用劑量不同而表現(xiàn)出不同的耐藥機制的相關報道較少。本研究中，與單用AMK比較，SH與AMK聯(lián)用后的抑制率先降低后升高的具體機制仍不清楚，筆者認為SH可能通過抑制細菌生物被膜、氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶、外排泵的表達來達到抗菌作用。因此，后續(xù)研究將進一步對其抗菌機制深入探討。

綜上所述，SH能夠在體外抑制MDR-AB，與單用AMK相比，聯(lián)用后隨著AMK水平的升高其抗菌作用先降低后升高。因此，建議使用AMK治療的患者應合理選擇食用魚腥草及相關制劑。