張蓋天 祁惠 楊鎖寧 褚志云 田甜 袁素霞 劉春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

觀賞器官形狀、色彩以及香氣是開花植物吸引傳粉動(dòng)物、維持繁衍進(jìn)化基石中最重要的幾個(gè)因素［1］。花色的成因背景十分復(fù)雜，由顯色物質(zhì)、著色細(xì)胞生理環(huán)境、著色細(xì)胞形狀與外界環(huán)境如光照、雄蕊完整性及授粉情況等因素共同決定，其中顯色物質(zhì)被認(rèn)為是最重要的因素［2-3］，因此有關(guān)花色研究的大部分內(nèi)容主要集中在顯色物質(zhì)上［4-6］。顯色物質(zhì)主要有類胡蘿卜素、類黃酮（包括花青素）等色素及金屬離子構(gòu)成，其中色素，尤其是花青素是花和果實(shí)呈色的主要的顯色物質(zhì)［2］?；ㄇ嗨刂饕?大種，分別為天竺葵素、矢車菊素、芍藥花素、矮牽牛素、飛燕草素和錦葵花素，其中芍藥素派生于矢車菊素，矮牽牛素與錦葵花素派生于飛燕草素。藍(lán)花多含飛燕草素及其衍生物，紅花往往含天竺葵素。花色苷修飾過程中，會(huì)先發(fā)生糖基化，后可在糖基化位點(diǎn)上經(jīng)過酶促反應(yīng)進(jìn)一步酰基化，使花色苷本身更為穩(wěn)定。此外，B-ring上羥基增多會(huì)使由花青素衍生出的色素顏色變藍(lán)，而3′，5′羥基甲基化會(huì)使色素顯紅［7］。Noda等［8］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育藍(lán)色菊花的過程中，在相同的遺傳背景下，介導(dǎo)入相同的基因后，分別出現(xiàn)了紫羅蘭色到藍(lán)色的不同顏色的菊花，在藍(lán)色的菊花中，飛燕草素-3′，5′-葡萄糖苷的占比要顯著高于紫羅蘭色的菊花。

花色苷單體在介質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)紫色而非藍(lán)色，輔色素與花色苷形成共色素沉著后，能夠維持顯色物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可呈現(xiàn)出藍(lán)色［9］。在體外模擬八仙花萼片成色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同輔色素在相同的溶液背景中，呈現(xiàn)出淺紫、深紫、藍(lán)這3種不同的顏色［10］，這說明不同輔色素結(jié)合其它色素物質(zhì)后的成色并不相同。

部分植物金屬離子可與沉著物螯合顯示特異的顏色。部分粉色繡球花品種，在酸性土壤條件下施鋁，萼片組織細(xì)胞就會(huì)吸收過量鋁離子，為避免鋁毒害，經(jīng)鋁調(diào)蛋白作用將鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)，鋁離子在液泡內(nèi)與共色素沉著物形成螯合物后，花瓣顯現(xiàn)藍(lán)色［11］。郁金香品種“Murasakizuisho”的花瓣基底部為藍(lán)色，上半部為紫色，測(cè)定發(fā)現(xiàn)這兩部分花色苷、輔色素、液泡pH均無顯著性差異，但藍(lán)色部分的Fe3+含量是紫色部分的25倍［12］。鴨跖草藍(lán)花的色素物質(zhì)，是由2個(gè)Mg2+結(jié)合6個(gè)飛燕草素花色苷、2個(gè)Mg2+結(jié)合6個(gè)類黃酮，而形成的的超分子配合物［13］。矢車菊蘭花的色素類物質(zhì)，是由1個(gè)Fe3+、1個(gè)Mg2+分別結(jié)合3個(gè)矢車菊花色苷、2個(gè)Ca2+分別結(jié)合3個(gè)芹黃素而形成的超分子配合物［14］。

液泡是由液泡膜包被的充滿液體的區(qū)室，也是植物儲(chǔ)存色素的器官，大而成熟的細(xì)胞中液泡體積占細(xì)胞體積的90%［15］。液泡內(nèi)顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性及存在狀態(tài)由著色細(xì)胞生理環(huán)境所決定［16］。研究表明，隨著液泡pH的升高，部分植物花器官會(huì)出現(xiàn)由粉、紅到紫、藍(lán)的轉(zhuǎn)變［17］。這種顏色變化現(xiàn)象的產(chǎn)生與花色苷類物質(zhì)存在的狀態(tài)密切相關(guān)，不同狀態(tài)的花色苷類物質(zhì)吸收光譜有不同的紅移或藍(lán)移效應(yīng)［16］。

1 花器官液泡pH對(duì)花色的影響

在花青素類觀賞植物中，顯色物質(zhì)組成相同，顯色物質(zhì)存在的狀態(tài)不同，呈現(xiàn)的花色不同。保持這類植物顯色物質(zhì)穩(wěn)定性的方式有花色苷的自締合作用和花色苷與輔色素結(jié)合的共色素沉著作用。自締合作用中多個(gè)花青素發(fā)色團(tuán)疊加在同一個(gè)左旋軸上，不同角度的遷移導(dǎo)致分裂的圓偏光二色性曲線產(chǎn)生，即光譜有不同的紅移或藍(lán)移趨勢(shì)［16］（圖1）；共色素沉著是顯色物質(zhì)疏水堆積使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)花色苷與輔色素濃度、種類有要求，即濃度越高，疏水力越強(qiáng)，顯色物質(zhì)越穩(wěn)定，顏色可由紅向藍(lán)紫移動(dòng)。這些全部依賴于一定的液泡pH，液泡pH改變時(shí)水合能力改變，著色物質(zhì)為適應(yīng)水合環(huán)境，調(diào)整自身使其穩(wěn)定，顏色發(fā)生改變［10，18］。合適的花色苷與輔色素形成共色素沉著后，還可避免花色苷不穩(wěn)定的無水堿基形成甲基醇從而不顯色，且pH在3-6的區(qū)間內(nèi)輔色素槲皮苷才能和花色苷、金屬離子形成絡(luò)合物［19］。

大豆紫花胞液pH為5.73-5.77，而藍(lán)花胞液pH為6.07-6.10［20］。類似地，矮牽牛紅色花花瓣勻漿pH在5.5左右，而紫色花瓣勻漿pH在6.0左右［21］；飛燕草花瓣表皮組織在紫紅色時(shí)pH為5.5，紫藍(lán)色時(shí)pH為6.6［22］。另外，一些植物花瓣液泡的pH也顯示出類似的變化趨勢(shì)。日本牽牛從花蕾到綻放，花瓣液泡pH一直升高，花蕾時(shí)期紫紅色的細(xì)胞液泡pH為6.6，而開花后藍(lán)色細(xì)胞液泡的pH為7.7［23-24］；同樣，在八仙花上，用質(zhì)子選擇微電極精準(zhǔn)測(cè)量著色細(xì)胞液泡，藍(lán)色花的液泡pH均值為4.1，而紅色花為3.3［25］。葡萄風(fēng)信子的穗狀花序上半部分為藍(lán)色，下半部分為紫色，紫色部分的勻漿pH為5.84，藍(lán)色部分為5.91［26］。葛根花序上同時(shí)有不同時(shí)間開放的花，新開的花為紫紅色，pH為5.2，老花為紫羅蘭色，pH為5.5［27］。

自然界中沒有藍(lán)色月季花，月季的DRF基因無法將二氫楊梅酮作為底物反應(yīng)生成飛燕草素花色苷，致使無藍(lán)色月季的誕生。研究人員在試驗(yàn)了多種月季品種后選擇了輔色素含量和液泡pH均高的品種作為寄主，將三色堇的F3′5′H基因與荷蘭鳶尾的DFR基因構(gòu)建二元載體導(dǎo)入寄主，在月季DFR基因SiRNA表達(dá)的共同作用下，寄主花瓣最終呈現(xiàn)淡紫色。這對(duì)藍(lán)色月季的培育具有里程碑式的意義［28］。由此可以得出結(jié)論，除飛燕草素花色苷外，較高的液泡pH與高含量的輔色素也是藍(lán)色月季花形成必不可少的元素，這兩個(gè)重要因子在在仙客來、菊花和康乃馨上同樣有所印證［28-29］。

圖1 花色苷堆積偏旋模式及CD曲線展示[17]Fig. 1 Anthocyanins stacking pattern and CD curve display[17]

2 調(diào)控花器官液泡pH的分子機(jī)理

Wilson等［30］在水稻和玉米上發(fā)現(xiàn)，將原來的pH為5.0的營(yíng)養(yǎng)液調(diào)至pH為8.5，兩種作物根部液泡pH均出現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，5-10 min 后恢復(fù)原來的pH；在玉米營(yíng)養(yǎng)液中加入NH3，使?fàn)I養(yǎng)液pH升至8.5，玉米根部液泡pH由5.5左右升至6.1左右，并穩(wěn)定下來；在水稻營(yíng)養(yǎng)液中加入NH3，水稻根部液泡pH由5.4左右升至5.9左右，很快恢復(fù)至pH為5.4左右，并趨于穩(wěn)定，這表明液泡具有一套隔離外界環(huán)境、獨(dú)立調(diào)控內(nèi)部pH的系統(tǒng)。

由于著色細(xì)胞液泡的pH在花色調(diào)控中起重要作用，因此研究調(diào)控花器官液泡pH的分子機(jī)理對(duì)于花色調(diào)控具有非常重要的價(jià)值。前人在調(diào)控著色細(xì)胞液泡pH的研究中，以日本牽牛與矮牽牛作為模式植物，闡明了著色細(xì)胞液泡堿化與酸化的分子機(jī)理［31］。

2.1 液泡酸化

野生型矮牽?；ü诔始t色，矮牽牛突變體出現(xiàn)與原有表型有色差的扇形色塊，或花冠整體顏色偏紫。研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色區(qū)域，其液泡pH也不同。

通過進(jìn)一步分離雜交實(shí)驗(yàn)，共分離出PH1-PH7 7個(gè)調(diào)控著色細(xì)胞液泡pH酸化的基因［32-34］。其中PH4編碼R2R3 MYB蛋白（myeloblastosis 蛋白），PH6（后更名為AN1）屬于bHLH 蛋白（basic helixloop-helix 蛋白），這兩個(gè)蛋白與WDR蛋白（WD是由40個(gè)氨基酸組成，以色氨酸W、天冬氨酸D結(jié)尾的結(jié)構(gòu)域；WDR是WD重復(fù)）AN11結(jié)合，形成MBW（MYB-bHLH-WD）復(fù)合物，調(diào)節(jié)花青素晚期合成通路；PH4-AN1-AN11還激活PH3轉(zhuǎn)錄，PH3編碼WRKY蛋白（含WRKYGQK 7個(gè)保守的氨基酸序列和16個(gè)氨基酸的鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子），可與AN11綁定，與PH4-AN1-AN11形成復(fù)合蛋白，在前饋環(huán)中轉(zhuǎn)錄PH5，同時(shí)，PH1也受PH4-AN1-AN11 以 及 PH3 的 調(diào) 控［20-21，35-37］（ 圖 2）。PH5 表達(dá)還受AN2轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控；PH1、PH5表達(dá)均略晚于DRF基因的表達(dá)，可能是因?yàn)镻H1、PH5表達(dá)需要花青素積累；PH1、PH5表達(dá)不影響花青素種類、數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化，不影響細(xì)胞形狀［38-40］。

矮牽牛在PH3調(diào)控下花冠呈紅色，ph3突變體中，PH1、PH5表達(dá)減少，花冠表皮著色細(xì)胞液泡pH升高，顏色呈灰紫色。即使PH5過表達(dá)，也不足以使突變體表型恢復(fù)正常，但是當(dāng)PH1也同時(shí)過表達(dá)時(shí)，ph3突變體可以恢復(fù)正常表型。這說明PH1、PH5形成復(fù)合體后，向花冠表皮著色細(xì)胞液泡泵入H+的能力成倍提高［40］。PH5編碼一個(gè)P3AATPase質(zhì)子泵，該質(zhì)子泵主要負(fù)責(zé)向花冠表皮著色液泡泵入H+。PH1編碼的P3B-ATPase，缺乏陽離子結(jié)合與易位的關(guān)鍵——保守天冬氨酸殘基，故不能行使質(zhì)子泵功能，故液泡酸化過程中作為PH5的輔因子，與PH5形成雜聚肽復(fù)合物，共定位于花冠表皮著色液泡上，增強(qiáng)PH5轉(zhuǎn)運(yùn)H+的能力，實(shí)現(xiàn)液泡高酸化［41］。PH1、PH5的同源基因廣泛分布于被子植物中［31］。

圖2 PH基因編碼蛋白調(diào)控液泡酸化可能的模式圖Fig.2 The possible pattern of vacuole reduced pH by PH genes encoded protein

除控制液泡酸化之外，PH基因還在花青素合成通路、花器官著色細(xì)胞小型液泡類似物vacuolino與中央大液泡融合以及花器官發(fā)育等其它方面起著特殊作用。

PH1與膜蛋白運(yùn)輸有關(guān)。Faraco等［42］在矮牽?；ü谥?xì)胞與月季的花瓣表皮著色細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一類在花器官表皮著色細(xì)胞中存在、而在葉肉細(xì)胞中并不存在的液泡類似物vacuolino。復(fù)合質(zhì)子泵PH1-PH5出現(xiàn)在vacuolino膜上，中央大液泡上的蛋白受體識(shí)別PH1后，二者形成鏈栓結(jié)構(gòu)，相互融合，PH1-PH5進(jìn)入之前無這兩種蛋白的中央大液泡，這是一種膜蛋白運(yùn)輸方式的分支。矮牽牛突變體ph3和ph4中，vacuolinos無法產(chǎn)生；ph1突變體中vacuolinos與中央大液泡無法融合。

矮牽牛PH3基因與擬南芥TTG2基因高度同源且功能上可以互相代替，由于TTG2參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累和液泡酸化，因此PH3基因除了液泡酸化功能外，也參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累［35］。

矮牽牛中純合ph3會(huì)導(dǎo)致雌性不育，且會(huì)遏制F3′5′H基因的表達(dá)；花褪色顯性等位基因Fa，只在ph3ph3和ph4ph4背景下表達(dá)［41］；隨著矮牽?；ü诘睦匣?，變紫的背景下出現(xiàn)的紅色斑點(diǎn)與扇區(qū)和ph7 有關(guān)［33］。

另外，PH基因還參與果實(shí)風(fēng)味調(diào)控。從柑橘果實(shí)液囊中分離出CsPH5，CsPH5為PhPH5的同源基因，主要負(fù)責(zé)向果肉液囊中泵入氫離子，提高果實(shí)風(fēng)味［43］。但甜瓜中的PH基因編碼的蛋白相似性最高的蛋白是PINs家族的蛋白，即H+/auxin泵，且該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，基因沉默后并未發(fā)生生長(zhǎng)素缺失的表型［44］。

對(duì)這兩種調(diào)控植物花器官與果實(shí)器官酸度的不同基因家族的研究表明，不同植物、不同部位PH基因需要深入研究其功能與意義。

2.2 液泡堿化

NHX基因?qū)儆贑PA（一價(jià)陽離子逆轉(zhuǎn)蛋白）家族，該家族廣泛的分布于細(xì)菌、真菌及高等動(dòng)植物中，參與調(diào)控細(xì)胞周期與增殖，耐鹽性，囊泡販運(yùn)與生物發(fā)生［45］。研究發(fā)現(xiàn)，NHX1基因編碼的蛋白被定位于液泡上，可以使液泡外Na+/K+置換液泡內(nèi)H+，使得液泡pH升高。此前有關(guān)NHX1的研究大多集中于抗鹽脅迫，除此之外它還具備了調(diào)控植物花色的本領(lǐng)［46］。

日本牽牛從花蕾到開放顏色由粉至紫或藍(lán)的過程中，色素類物質(zhì)并不改變，僅液泡pH不斷地在提高［47］。Fukada-Tanaka等［24］發(fā)現(xiàn)，日本牽?；ǖ腜r基因負(fù)責(zé)升高液泡pH使花冠變藍(lán)，Pr基因與擬南芥和水稻Na+/H+交換器閱讀框高度同源，且能補(bǔ)充酵母nhx1突變，故命名 Pr基因編碼的蛋白為lnNHX1。lnNHX1也是第一個(gè)被鑒別出來調(diào)控液泡pH升高使花色變藍(lán)的蛋白。lnNHX1基因在開花前12 h的花瓣中表達(dá)最豐富，開花0 h時(shí)lnNHX1所編碼的蛋白含量最高，在這一液泡pH升高的過程中，并沒有鹽脅迫的情況發(fā)生［23］。

進(jìn)一步的研究表明，僅在日本牽牛開花時(shí)的著色細(xì)胞液泡膜上觀察到lnNHX1，其是使液泡堿化花瓣變藍(lán)的主要原因［48］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，除lnNHX1外可能沒有其它主要基因在花期促進(jìn)液泡堿化，盡管也有研究表明部分lnNHX1缺失突變體可以在開花時(shí)花枝顏色變紫，但這一現(xiàn)象被推測(cè)為是其它一些基因參與協(xié)作的結(jié)果。此外，lnNHX2主要在葉片、莖、根中表達(dá)，研究表明lnNHX2也可使?fàn)颗；ㄩ_放時(shí)部分細(xì)胞液泡堿化花瓣變紫［49］，說明lnNHX2也具有液泡堿化的部分功能。

3 展望

花色研究一直是觀賞植物研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，花器官有色細(xì)胞液泡pH作為影響花色呈現(xiàn)的重要因素，其研究對(duì)象受限于以下兩點(diǎn)：第一，試驗(yàn)材料顏色不同并非因色素類物質(zhì)種類、含量不同；第二，試驗(yàn)材料顏色不同并非因有色細(xì)胞形狀發(fā)生變化（如皺縮等）。所以，研究花器官液泡pH對(duì)花色影響的植物種類十分重要。目前，有關(guān)花器官液泡pH對(duì)花色的分子調(diào)控在日本牽牛和矮牽牛中的研究較為深入。在矮牽牛中，而PH1與PH5在液泡pH酸化過程中起關(guān)鍵作用；而在日本牽牛中，液泡的pH變化主要依靠NHX1行使功能。

但是，有色細(xì)胞液泡pH參與調(diào)控其他觀賞植物花器官顏色變化的機(jī)理研究相關(guān)資料甚少，這導(dǎo)致我們對(duì)于有色細(xì)胞液泡pH變化的機(jī)理不甚了解。從現(xiàn)有研究來看，在矮牽牛中，有色細(xì)胞液泡pH調(diào)控的相關(guān)基因與花色苷形成和其育性密切相關(guān)［28-32］。這證明了在進(jìn)化過程中，不論是有色細(xì)胞液泡pH調(diào)控還是花色苷形成均與植物繁殖有關(guān)。

綜上所述，有關(guān)于調(diào)控花器官有色細(xì)胞液泡pH的基因及其功能，挖掘還不夠全面，部分基因僅有名稱報(bào)道，但未見功能驗(yàn)證，故有關(guān)的pH基因有待于進(jìn)行深入研究，以期為進(jìn)一步良種繁育以及創(chuàng)建花色形成的環(huán)境調(diào)控技術(shù)體系奠定理論基礎(chǔ)。

隨著基因工程育種體系的進(jìn)一步發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在觀賞植物上的應(yīng)用逐漸增多，科研與商業(yè)化要求對(duì)基因在現(xiàn)有植株中的功能及物種進(jìn)化中的作用需要有非常清晰的認(rèn)知，以方便開展轉(zhuǎn)基因及人為促進(jìn)物種進(jìn)化的相關(guān)工作。研究花器官著色細(xì)胞液泡pH對(duì)花色的調(diào)控，明確液泡pH相關(guān)基因功能及花色調(diào)控機(jī)制，在觀賞植物的花色調(diào)控和分子育種中具有重要的意義。