徐文迪，田那科·沙帕爾，劉奎杰，韓同，趙華

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 胃腸外科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種全球性的常見病，是已知癌癥中第三大最常見類型，占全世界癌癥死亡主要原因的第二位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2018年，我國(guó)CRC新發(fā)病例數(shù)為521 590，占所有癌癥新發(fā)病例的12.2%。因罹患CRC而死亡的病例數(shù)為247 563，占所有癌癥病死率的8.6%[2]。而最新的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明，預(yù)計(jì)到2021年，僅美國(guó)就將有104 270例新增CRC癌癥病例及52 980例癌癥死亡病例[3]。

中國(guó)大多數(shù)CRC是結(jié)腸腺癌（colon-adenocarcinoma，COAD）是發(fā)生于腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是結(jié)腸癌最主要的病理類型之一。其他罕見類型包括鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌、梭形細(xì)胞癌和未分化癌[4-5]。CRC是一種異質(zhì)性疾病，大約60%～65%的病例是偶發(fā)的，是通過(guò)獲得性體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳變異引起的，這些變異主要?dú)w因于可改變的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素[6]。CRC患者的預(yù)后取決于癌癥的TNM分期和是否接受治愈性手術(shù)干預(yù)，但這僅限于原發(fā)早期的CRC患者。此外，CRC患者的臨床表現(xiàn)，治療效果和預(yù)后還受到例如表觀遺傳狀態(tài)和導(dǎo)致CRC異質(zhì)性的微環(huán)境等許多因素的影響[7]。

諸多研究表明，確定能夠早期進(jìn)行診斷，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)患者病情發(fā)展及其對(duì)治療的反應(yīng)的生物標(biāo)志物，對(duì)CRC患者進(jìn)行早期診斷或切除是治愈大多數(shù)CRC患者的關(guān)鍵[8-9]。對(duì)于CRC的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)率，盡管最近的研究中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物對(duì)改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)[10-14]。但由于各種原因，諸如對(duì)小型發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的過(guò)度擬合和缺乏足夠的臨床驗(yàn)證之類的問(wèn)題，將便捷精確的篩選生物標(biāo)志物的方法納入常規(guī)臨床實(shí)踐仍未實(shí)現(xiàn)。

近年來(lái)，由于飛速發(fā)展的微陣列技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，為尋找與癌癥相關(guān)診斷、治療和預(yù)后的關(guān)鍵的生物標(biāo)志物提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)[15]。但由于數(shù)據(jù)的多樣性及數(shù)據(jù)集之間潛在的生物學(xué)異質(zhì)性和跨測(cè)量平臺(tái)的技術(shù)偏見，以及研究基因表達(dá)水平所使用的傳統(tǒng)方法需要適當(dāng)?shù)臍w一化，這些困難的任務(wù)為高效地利用生物信息帶來(lái)了艱巨的挑戰(zhàn)[16]。為了應(yīng)對(duì)消除數(shù)據(jù)預(yù)處理（例如縮放和歸一化）局限性的問(wèn)題，研究人員提出了一種基于基因表達(dá)水平相對(duì)排名的方法，已在包括癌癥分類在內(nèi)的各種應(yīng)用中均可得到可靠結(jié)果[17-19]。

研究[20-21]表明，免疫逃逸、能量異常、基因突變、促瘤炎癥成為了新的腫瘤標(biāo)志。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所涉及的免疫系統(tǒng)的各種成分已被證明是癌癥的關(guān)鍵性因素[22-23]。

本研究探討一種由免疫相關(guān)基因（immunerelated gene，IRG）組成的免疫相關(guān)基因?qū)χ笖?shù)（immune-related gene pair index，IRGPI）為預(yù)后標(biāo)志模型的構(gòu)建，并且在癌癥基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)集中與CRC患者的臨床信息相關(guān)聯(lián)后對(duì)其進(jìn)行了一系列的研究，從而證明免疫相關(guān)基因?qū)Γ↖RGP）與CRC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

通過(guò)公開數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性研究。本研究選擇了2個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集，包括TCGA-COAD（臨床數(shù)據(jù)集452例，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集449例）以及GSE39582（585例）[24]，數(shù)據(jù)收集的時(shí)間為2020年4月25日—6月20日。其中TCGA-COAD數(shù)據(jù)集因其高質(zhì)量的臨床記錄及完善的長(zhǎng)期隨訪而被用作訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，其臨床信息、基因表達(dá)矩陣從TCGA門戶（https://portal.gdc.cancer.gov）下載。為了驗(yàn)證TCGA數(shù)據(jù)集中的研究結(jié)果，從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載了驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE39582中的基因表達(dá)矩陣和臨床數(shù)據(jù)作為外部驗(yàn)證。

對(duì)于TCGA-COAD及GEO數(shù)據(jù)集，基于每組注釋文件將表達(dá)譜從探針?biāo)睫D(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因符號(hào)，而沒有進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于同一個(gè)基因符號(hào)對(duì)應(yīng)不同的表達(dá)值，將表達(dá)值其取均數(shù)。本研究通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，僅將具有完整臨床生存信息的患者用于后續(xù)分析。

1.2 CRC 特異性IRGP 的構(gòu)建

進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)集預(yù)后IRGP的構(gòu)建[25]。于2020年3月28日從ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)（https://immport.niaid.nih.gov）下載了2 498個(gè)IRG用于構(gòu)建IRGP。IRG包含17類，其中包括腫瘤壞死因子家族成員、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族成員、趨化因子及細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、干擾素等。

對(duì)本研究所涉及的TCGA及GEO平臺(tái)上進(jìn)行了變化相對(duì)較大（絕對(duì)偏差中值（median absolute deviation，MAD）＞0.5）的IRG的測(cè)量。對(duì)每個(gè)樣品中的IRG的表達(dá)值之間進(jìn)行成對(duì)比較，以獲得每個(gè)IRGP的得分。如果在特定IRGP中第1個(gè)IRG的表達(dá)水平高于第2個(gè)IRG，則該IRGP的得分為1。否則，分?jǐn)?shù)為0。去除變異相對(duì)較小的IRGP（80%以上的數(shù)據(jù)集樣本中IRGP的分?jǐn)?shù)為0或1，這意味著樣本之間變化很微小）后，剩下的IRGP被保留下來(lái)作為初始候選IRGP用于進(jìn)行后續(xù)分析。

這種基于基因成對(duì)比較的方法具有顯著優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵摲椒ㄊ峭耆谀[瘤樣本的基因表達(dá)譜來(lái)計(jì)算的得分，可以不需要標(biāo)準(zhǔn)化而以個(gè)性化的方式使用[22]。

1.3 IRGPI 的構(gòu)建

為得到最穩(wěn)定的基因?qū)δＰ蛠?lái)構(gòu)建預(yù)后標(biāo)志，將TCGA-COAD數(shù)據(jù)集以及GEO數(shù)據(jù)集中的臨床數(shù)據(jù)整理，得到CRC患者樣本中的生存時(shí)間及生存狀態(tài)，將其與初始IRGP相合并，運(yùn)用Cox回歸及Kaplan-Meier法選擇與CRC預(yù)后顯著相關(guān)的IRGP（P＜0.001）。為了避免數(shù)據(jù)過(guò)度擬合的風(fēng)險(xiǎn)，選擇預(yù)后顯著相關(guān)的IRGP，使用R軟件包“glmnet”（版本：3.0-2）應(yīng)用Lasso-Cox回歸（迭代1 000次），并最終選擇了20個(gè)IRGP定義為最終IRGPI。

使用R 語(yǔ)言包“survivalROC”（版本：1.0.3）、“survival”（版本：3.1-11）構(gòu)建時(shí)間依賴性受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，用以確定IRGPI的最佳截止（cut-off）值，從而將CRC患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。

1.4 IRGPI 的驗(yàn)證

為了評(píng)估IRGPI標(biāo)志的價(jià)值，首先通過(guò)Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)對(duì)CRC患者繪制了生存曲線。隨后選擇了高-低風(fēng)險(xiǎn)組的相關(guān)臨床因素，通過(guò)單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析來(lái)評(píng)估IRGPI。在單變量分析中，針對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集中的臨床因素、病理因素及IRGPI進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。隨后，在多變量Cox分析中將IRGPI與可用的臨床和病理變量相結(jié)合，年齡、性別及T、N分期被視為連續(xù)變量，從而進(jìn)一步對(duì)IRGPI進(jìn)行評(píng)估。

1.5 浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的分析

采用一種可預(yù)測(cè)新鮮，冷凍及固定組織（包括實(shí)體瘤）免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的流行算法，CIBERSORT[26]，以便用于了解不同風(fēng)險(xiǎn)人群的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。CIBERSORT是一種從復(fù)雜組織的基因表達(dá)譜中表征其細(xì)胞組成的方法，對(duì)于緊密相關(guān)的細(xì)胞類型方面優(yōu)于其他方法。CIBERSORT對(duì)腫瘤樣品進(jìn)行去卷積算法，對(duì)于每種細(xì)胞類型都使用了支持向量回歸[27]。對(duì)于每個(gè)樣品，CIBERSORT能夠推斷出22種浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相對(duì)比例。使用R軟件包“CIBERSORT R script”（版本：1.03）對(duì)每一個(gè)樣本進(jìn)行了浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相對(duì)比例的計(jì)算。

1.6 功能注釋和分析

為了在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上了解構(gòu)成IRGPI的IRG的真實(shí)表達(dá)，使用了人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA，https://www.proteinatlas.org/）。HPA是一個(gè)可公開獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)，包含近20種常見癌癥的基于免疫組織化學(xué)的表達(dá)數(shù)據(jù)，并且可提供一張基于組織和器官及微陣列的免疫組化的人類組織蛋白質(zhì)組圖譜。從而顯示了不同正常組織和癌癥組織中蛋白質(zhì)的空間分布[28-29]。

為了能夠了解IRGPI的相關(guān)生物學(xué)功能，本研究通過(guò)R 語(yǔ)言包“cluster Profiler”（版本：3.14.3）對(duì)構(gòu)成IRGPI的IRG進(jìn)行了基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。為了明確高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組之間顯著改變的G O 途徑，在兩基因組間使用Bioconductor軟件包“FGSEA”（版本，1.12.0）進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[30]。本研究中涉及的生物學(xué)過(guò)程是使用了MSigDB（Molecular Signatures Database）標(biāo)記基因集，選擇P＜0.05的數(shù)據(jù)作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因集。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均使用R 語(yǔ)言軟件（版本3.6.1，https//www.r-proje ct.org/）及SPSS軟件（SPSS version 22）進(jìn)行。對(duì)于所有測(cè)試，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IRGPI 的構(gòu)建及定義

整個(gè)工作流程如圖1所示。本研究共納入有完整臨床數(shù)據(jù)的1 018個(gè)樣本（表1）。TCGA-COAD隊(duì)列作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，GSE39582隊(duì)列作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。從ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的2 498個(gè)IRG來(lái)構(gòu)建IRGP。在所有數(shù)據(jù)集中均進(jìn)行了測(cè)量，并滿足訓(xùn)練集上的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（中位絕對(duì)偏差MAD＞0.5）后，共挑選出有473個(gè)IRG，并且構(gòu)建了個(gè)111 392個(gè)IRGP。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中刪除相對(duì)變異較小的IRGP之后，得到12 275個(gè)IRGPs。隨即合并樣本臨床信息，選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）的28個(gè)IRGP作為初始候選IRGP。對(duì)于初始候選IRGP使用了Lasso Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸并且經(jīng)過(guò)了1 000次的隨機(jī)循環(huán)，最終選擇了20個(gè)IRGP構(gòu)成IRGPI。IRGPI由28個(gè)唯一的IRG組成（表2）。

圖1 構(gòu)建及驗(yàn)證與CRC 患者IRGP 標(biāo)志的工作流程Figure 1 The workflow of constructing and verifying the IRGP signature in CRC patients

表1 TCGA-COAD 和GSE39582 數(shù)據(jù)集患者的臨床特征Table 1 Patient demographics and clinical characteristics in TCGA-COAD and GSE39582 datasets

表2 IRGPI 的相關(guān)信息Table 2 Information on the IRGPI

2.2 IRGPI 的驗(yàn)證和評(píng)估

時(shí)間相關(guān)的ROC曲線IRGPI最佳截止值為-1.239（圖2）。根據(jù)CRC患者總生存率（overall survival，OS），使用IRGPI的最佳截止值將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的患者分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組（表1）。根據(jù)分析可知高風(fēng)險(xiǎn)組的OS明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P=1.295×10-11，HR=6.51，95%CI=3.79～11.21）（圖3A）。

對(duì)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析，以便于進(jìn)一步了解IRGPI是否可以作為CRC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。在單變量Cox分析中，患者的年齡及腫瘤的T、N分期以及IRGPI對(duì)預(yù)后的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在多變量分析中，IRGPI標(biāo)記仍舊是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后相關(guān)因素（圖4A-B）。為了明確在不同人群中IRGPI是否具有與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集類似的預(yù)后價(jià)值，將相同的公式應(yīng)用于驗(yàn)證數(shù)據(jù)集（GSE39582）作為外部驗(yàn)證。按照與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集同樣的分組標(biāo)準(zhǔn)，將驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的患者分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組，然后進(jìn)行相關(guān)生存分析后可得到與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集類似的結(jié)果。高風(fēng)險(xiǎn)組的OS明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P=0.000 1，HR=1.82，95%CI=1.36～2.44）（圖3B）。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，仍舊采用單變量和多變量Cox回歸分析。最終分析結(jié)果表示：無(wú)論在單變量以及多變量Cox回歸分析當(dāng)中，IRGPI均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，IRGPI標(biāo)記為影響CRC患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素（圖4C-D）。

2.3 高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

前期研究[23,31]顯示，CRC細(xì)胞凋亡與其微環(huán)境中免疫細(xì)胞凋亡和浸潤(rùn)程度密切相關(guān)。CIBERSORT已經(jīng)用于癌癥微環(huán)境的相關(guān)研究中，其可以對(duì)實(shí)體腫瘤樣品進(jìn)行去卷積從而估計(jì)免疫細(xì)胞亞群[32-33]。本研究使用CIBERSORT來(lái)評(píng)估不同風(fēng)險(xiǎn)組中每位患者的22種不同免疫細(xì)胞的相對(duì)比例。圖5A描繪了高-低風(fēng)險(xiǎn)組使用CIBERSORT輸出的免疫細(xì)胞豐度的匯總，不同的風(fēng)險(xiǎn)組所浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞表達(dá)量有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（P=0.007）巨噬細(xì)胞（M0）（P=0.024）在高風(fēng)險(xiǎn)組中顯著高表達(dá)，而在低風(fēng)險(xiǎn)組中靜息樹突狀細(xì)胞（dendritic cells resting，P=0.006），靜息CD4+記憶T細(xì)胞（P=1.784e-05）的百分比明顯升高（圖5B）。

圖2 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中IRGPI 的ROC 曲線 Figure 2 ROC curve of IRGPI in training dataset

圖3 高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的CRC 患者的OS 曲線 A：訓(xùn)練數(shù)據(jù)集；B：驗(yàn)證數(shù)據(jù)集Figure 3 OS curves of CRC patients in high-risk group and low-risk group A: Training dataset; B: Validating dataset

圖4 CRC 患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析的森林圖 A：基于單因素分析評(píng)價(jià)IRGPI 對(duì)TCGA-COAD 中CRC 患者預(yù)后的價(jià)值；B：基于多因素分析評(píng)價(jià)IRGPI 對(duì)TCGA-COAD 中CRC 患者預(yù)后的價(jià)值；C：基于單因素分析IRGPI 對(duì)GSE39582 中CRC 患者預(yù)后的價(jià)值；D：基于多因素分析IRGPI 對(duì)GSE39582 中CRC 患者預(yù)后的價(jià)值Figure 4 Forest plot of univariate and multivariate Cox regression analysis for the prognosis of CRC patients A: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on univariate analysis; B: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on multivariate analysis; C: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in GSE39582 based on univariate analysis; D: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TGSE39582 based on multivariate analysis

圖5 CRC 患者高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析 A：CIBERSORT 評(píng)估了高、低風(fēng)險(xiǎn)組中22 種免疫細(xì)胞豐度；B：特定免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的豐度分布Figure 5 Analysis of immunocyte infiltration in high and low risk groups of CRC patients A: CIBERSORT evaluation of the abundance of 22 immune cells in high and low risk groups; B: Abundance distribution of specific immune cells in high and low risk groups

2.4 IRGPI 的功能注釋

為了驗(yàn)證此模型中的IRG在組織蛋白中的表達(dá)，使用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫組織化學(xué)法分析了正常人組織和CRC組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。結(jié)果表明，與正常組織比較，CRC 組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A的表達(dá)上調(diào)（圖6）。為了解IRGPI標(biāo)志所涉及的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，對(duì)構(gòu)成IRGPI的28個(gè)IRG進(jìn)行了KEGG及GO富集分析。從KEGG的分析結(jié)果顯示，28個(gè)IRG所涉及的主要通路有：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)通路等（圖7A-B）（表2）。而GO分析表明，IRGPI中的相關(guān)IRG涉及的分子功能（MF）有：受體配體活性、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能。所涉及的生物過(guò)程（BP）有：白細(xì)胞遷移、細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)等過(guò)程。而涉及的細(xì)胞組成（CC）大致包括：膜區(qū)、分泌顆粒膜、免疫突觸等成分（圖7 C）。對(duì)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間進(jìn)行了GSEA分析，以研究顯著改變的GO過(guò)程?；贕SEA 的分析表明，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中高-低風(fēng)險(xiǎn)組之間顯著改變的生物學(xué)過(guò)程主要有：角化細(xì)胞分化、角化、表皮細(xì)胞分化、皮膚發(fā)育等過(guò)程 （圖7 D-E）。與腫瘤相關(guān)的功能注釋提供了IRGPI標(biāo)記影響分子機(jī)制的證據(jù)，從而可用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后。

圖6 CRC 組織中的蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)法的表達(dá)（×100）Figure 6 Expression of protein in CRC tissue by immunohistochemical method (×100)

圖7 IRGPI 的功能富集分析 A-B：28 個(gè)免疫特征基因的KEGG 富集分析結(jié)果；C：28 個(gè)免疫特征基因的GO 富集分析結(jié)果； D：高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間顯著改變途徑（角化，角質(zhì)形成細(xì)胞分化，表皮細(xì)胞分化，皮膚發(fā)育）的GSEA 分析結(jié)果； E：28 個(gè)免疫特征基因的基因集富集分析（GSEA）結(jié)果Figure 7 Functional enrichment Analysis of IRGPI A–B: Results of KEGG enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; C: Results of GO enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; D: GSEA analysis for significantly changed pathways between high and low risk groups (keratinization, epidermal cell differentiation, and skin development); E: Enrichment analysis (GSEA) 28 immune characteristic genes

3 討 論

隨著高速發(fā)展的微陣列技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，生物信息學(xué)技術(shù)成為了可以用于篩選生物標(biāo)志物的強(qiáng)有力工具。并且在多種類癌癥中得到了相關(guān)的應(yīng)用及驗(yàn)證[34-36]。針對(duì)于高發(fā)病率的CRC，我國(guó)目前的采取以手術(shù)治療為主，多學(xué)科綜合治療的原則。而就包括了目前正處于高速發(fā)展階段的免疫治療[37]。在之前有關(guān)免疫治療的研究中所提及的：在轉(zhuǎn)移性CRC患者錯(cuò)配修復(fù)缺陷治療中取得明顯療效的抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）藥物，使得CRC的免疫治療得到了進(jìn)一步的重視[38]。為了達(dá)到增加患者生存，延緩腫瘤進(jìn)展的目的，免疫治療可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，激發(fā)腫瘤特異性免疫，打破免疫耐受，重新激活免疫細(xì)胞等途徑從而識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞[39]。目前，比較熱門的免疫治療方式有腫瘤疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑以及小分子治療等，免疫治療在一定程度上改善了CRC 患者的預(yù)后，是一種有前景的治療選擇[40]。

對(duì)于CRC的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)率，盡管最近的國(guó)內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物對(duì)改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)[41-43]，但是從生物的復(fù)雜性，個(gè)體差異，以及免疫因素的考慮，迫切需要找到強(qiáng)有力的預(yù)后生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)CRC患者的生存情況，從而對(duì)CRC患者采取相應(yīng)的治療措施。本研究成功構(gòu)建了一種由28個(gè)IRG組成的20個(gè)IRGP作為預(yù)后標(biāo)志，并且在TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中均得到了其準(zhǔn)確性的驗(yàn)證，從而充分證明了IRGPI是與CRC患者預(yù)后相關(guān)的重要因素。

本研究詳細(xì)分析了這些構(gòu)成IRGPI的IRG，參與構(gòu)建20對(duì)IRGP的大多數(shù)基因是細(xì)胞因子、抗菌劑家族成員，它們對(duì)于免疫微環(huán)境的構(gòu)成中扮演者重要角色。通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析可知，CRC組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A基因在蛋白表達(dá)水平上較正常組織上調(diào)，表明這些基因在CRC組織中更為活躍。而在以前的研究中，提出APOD作為多種癌癥類型（包括CRC）的預(yù)后標(biāo)志物[44]；血清中AGR2參與了卵巢交界性腫瘤病情的發(fā)生、發(fā)展[45]； BTS-2的表達(dá)增強(qiáng)腎細(xì)胞癌的細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲性[46]；胃癌組織中BST2 mRNA高表達(dá)，與腫瘤惡性程度有關(guān)，有望成為診斷胃癌新的生物標(biāo)志物。BST-2 參與了人巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移[47]；骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)CCR5促進(jìn)CRC的進(jìn)展[48]；INHBB在CRC中過(guò)表達(dá)，并與浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，與CRC的不良OS和DFS正相關(guān)[49]；肝硬化患者血清中炎性趨化因子如CCL4和CCL5的高水平表明存在肝細(xì)胞癌[50]；CCR7在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[51]；PTGS2表達(dá)與大腸癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加和大腸癌特異性生存率降低有關(guān)[52]；CCL28作為趨化因子，大量研究表明其在不同腫瘤中的表達(dá)異于正常組織，研究CCL28在腫瘤生成中的調(diào)控的具體作用機(jī)制有助于明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為腫瘤的診療提供理論依據(jù)[53]；CRBP-1過(guò)表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)[54]；RBP7的異位表達(dá)增加了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[55]；STC2是CRC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，STC2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，晚期臨床階段和較差的臨床結(jié)局密切相關(guān)[56]；根據(jù)前人的研究可知上述的基因參與了腫瘤發(fā)展和預(yù)后的過(guò)程，從而有助于合理的認(rèn)為本研究中構(gòu)建的IRGPI中的其他IRG也與CRC患者的預(yù)后相關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

對(duì)于對(duì)IRG的功能注釋的結(jié)果可知IRGPI中一些基因在白細(xì)胞遷移、細(xì)胞趨化性、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。據(jù)相關(guān)研究表明，這些標(biāo)志所涉及的生物功能和途徑與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[57-61]。通過(guò)GSEA指出高風(fēng)險(xiǎn)組中主要腹肌的過(guò)程有：角化細(xì)胞分化、角化、表皮細(xì)胞分化、皮膚發(fā)育等，以上途徑在之前的研究中亦可證明與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[62-64]。

根據(jù)對(duì)高-低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫分析，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0在高危組中顯著高表達(dá)。在過(guò)去的研究中，可知調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0增多，對(duì)腫瘤免疫產(chǎn)生負(fù)面影響，并與不良預(yù)后相關(guān)[65-68]。而對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)組高表達(dá)的靜息樹突狀細(xì)胞，腫瘤浸潤(rùn)性樹突狀細(xì)胞在直腸癌組織中低表達(dá)，不成熟細(xì)胞比例增加，與TNM分期和腫瘤直徑有關(guān)[22]。靜息CD4+記憶T細(xì)胞與腫瘤更好的預(yù)后相關(guān)[69]。以上這些研究結(jié)果表明，IRGPI標(biāo)記可作為CRC患者可靠的預(yù)后生物標(biāo)記物。

本研究采用了一種新的方法用于不同平臺(tái)數(shù)據(jù)的處理，相較于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志的研究是基于全基因組水平進(jìn)行的，本研究中所構(gòu)建的生物標(biāo)志是基于免疫相關(guān)基因而進(jìn)行的，并且采取了專門設(shè)計(jì)的分析流程及方法。傳統(tǒng)的生物信息學(xué)方法一般是根據(jù)正常或癌旁組織與腫瘤組織的基因表達(dá)差異來(lái)進(jìn)行后續(xù)的研究，需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及克服跨平臺(tái)的偏見，而本研究基于同一樣本基因表達(dá)譜內(nèi)每一個(gè)基因表達(dá)值的相對(duì)排名而進(jìn)行的成對(duì)比較后得到的一組分值來(lái)構(gòu)建IRGP。不僅可以避免不同數(shù)據(jù)庫(kù)及平臺(tái)產(chǎn)生的技術(shù)偏見以及因生物學(xué)異質(zhì)性而帶來(lái)的不同腫瘤個(gè)體間的偏差[70-71]，而且也可以克服傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析需要預(yù)處理數(shù)據(jù)的難點(diǎn)。從而得到與其他研究相比重復(fù)率較低且穩(wěn)健的生物標(biāo)志。本研究所使用的新方法在包括癌癥在內(nèi)的許多研究中均具有可靠的結(jié)果[17-19,25,72]。因此本研究所構(gòu)建的生物標(biāo)志可以實(shí)現(xiàn)單樣本、精準(zhǔn)化、高效率地評(píng)估CRC患者的預(yù)后，這是本研究所具有的優(yōu)勢(shì)之一。

在本研究中，IRGPI標(biāo)志物的構(gòu)建是使用與傳統(tǒng)研究不同的Lasso回歸經(jīng)過(guò)了1 000次的迭代構(gòu)建的，它可以避免過(guò)度擬合從而確定最佳的變量。利用CRC患者ROC曲線分析確定的最佳截止值，將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。經(jīng)過(guò)相關(guān)分析，兩組預(yù)后有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Lasso回歸以及ROC曲線的最佳截止值的相關(guān)應(yīng)用還可適用于其他不同的數(shù)據(jù)集和臨床隊(duì)列，這也是本研究所具有的重要優(yōu)勢(shì)。

本研究依舊具有局限性。首先，本研究采取的是回顧性分析，本研究所涉及的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集及驗(yàn)證數(shù)據(jù)集均使用公開數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本。雖然兩個(gè)大型公開數(shù)據(jù)庫(kù)擁有公認(rèn)的穩(wěn)定性及可靠性，但是對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)中石蠟切片樣品的穩(wěn)定性和有效性仍有待進(jìn)一步考證。如需進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果，則需要進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究。其次，本研究中所涉及的基因表達(dá)特征會(huì)受到由腫瘤內(nèi)生物學(xué)異質(zhì)性及統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差所帶來(lái)的影響。盡管使用了樣本量較大的TCGA及GEO兩個(gè)數(shù)據(jù)集，但仍舊需要包含具有不同樣本屬性的更多數(shù)據(jù)集，以進(jìn)行更廣泛的驗(yàn)證。最后，本研究所使用的基因表達(dá)矩陣是基于RNA-seq或微陣列平臺(tái)產(chǎn)生的，由于其價(jià)格高，轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)以及對(duì)生物信息學(xué)專業(yè)知識(shí)有較高要求而使其在日常臨床應(yīng)用中受到了一定的限制[73]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了由20個(gè)IRGPI標(biāo)志。并且了解它們作為一種生物標(biāo)志所擁有的預(yù)后價(jià)值。本研究中所構(gòu)建的IRGPI標(biāo)志是CRC患者的生存的獨(dú)立預(yù)后因素。通過(guò)進(jìn)一步生物學(xué)功能分析，可以了解這些IRGPI在CRC的發(fā)生發(fā)展中的功能，從而為CRC的治療方式提供了一種新的思路。該標(biāo)記或?qū)⒊蔀橐环N評(píng)價(jià)CRC患者是否能夠獲益于相關(guān)免疫治療的新型精準(zhǔn)化預(yù)測(cè)工具。