李夢(mèng)瑩，王耀群，孫夢(mèng)雨，邱潔萍，陳博

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普通外科，安徽 合肥 230000）

胃癌（gastric cancer，GC）是人類消化道中最常見的惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，GC已成為第五大最常被診斷出的癌癥和 第三大癌癥致死的原因，是全球性的重要健康危 機(jī)[2]。臨床上以手術(shù)切除、化療、放療或聯(lián)合靶向?yàn)橹鞯腉C治療方法難以徹底清除腫瘤病灶，腫瘤易進(jìn)展或復(fù)發(fā)且毒副作用大，患者的5年生存率低至10%～15%[3-4]，因此探索新的更有效的治療方法成為亟待解決的重大課題。

近年來腫瘤免疫治療作為一種新型的治療方法，基于人體的免疫系統(tǒng)，利用免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用，已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的臨床效果瘤生長(zhǎng)、發(fā)展和患者預(yù)后結(jié)局均與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況相關(guān)[5-7]。2018年，James P.Allison和Tasuku Honjo 等就因在“抑制免疫檢查點(diǎn)（CTLA-4、PD-1）抗腫瘤研究”中作出卓越貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。此外，已有研究表明，M2巨噬細(xì)胞在膀胱癌組織中富集，促進(jìn)血管生成，可作為膀胱癌潛在的免疫治療靶點(diǎn)[8]，有關(guān)自然殺傷細(xì)胞的多種腫瘤免疫治療也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[9]。由此可見，挖掘免疫細(xì)胞相關(guān)靶標(biāo)是優(yōu)化腫瘤免疫治療的有效路徑[10-11]。

過去這方面的研究多通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)來評(píng)估腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的組成，但這些方法都存在不足，并有可能導(dǎo)致細(xì)胞丟失或結(jié)果失真。Newman等[12]于2015年設(shè)計(jì)出了新的生物信息學(xué)算法—CIBERSORT，通過估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)子集和復(fù)雜組織標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)數(shù)據(jù)來鑒定細(xì)胞類型和被測(cè)樣本的免疫細(xì)胞組成。該法已經(jīng)在多種惡性腫瘤中進(jìn)行了很好的驗(yàn)證[13]，可以廣泛地應(yīng)用于惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制、腫瘤免疫等過程的生物信息學(xué)挖掘。另有研究表明，免疫治療與化療聯(lián)合在多種腫瘤治療中效果顯著,尋找腫瘤免疫的基因標(biāo)志物已經(jīng)成為當(dāng)下腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[14-15]。而作為鑒定與疾病相關(guān)的基因模塊和關(guān)鍵基因的理想方法，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）基于大樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)尋找潛在生物標(biāo)志物，已經(jīng)在眾多研究中被用來對(duì)宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤進(jìn)行分析，并成功篩選出了有效的基因靶點(diǎn)[16-17]。

綜上，為尋找可靠的GC相關(guān)免疫細(xì)胞相關(guān)基因靶標(biāo)，從而優(yōu)化GC患者的預(yù)后，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載GC的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用CIBERSORT算法逐一測(cè)算樣品的免疫細(xì)胞組成，構(gòu)建WGCNA，結(jié)合生存分析獲取其與GC預(yù)后的相關(guān)性并用外部數(shù)據(jù)庫(kù)加以驗(yàn)證，鑒定出GC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)預(yù)后基因，為進(jìn)一步明確潛在的GC免疫治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的采集

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了共407例基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中包括癌組織樣本375例，癌旁組織樣本32例。GC樣本臨床信息包含性別、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分級(jí)等。人類癌癥標(biāo)本核心資源庫(kù)的科研人員在采集、處理和分派癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本時(shí)，去除了患者的身份信息，因此不存在倫理問題。

1.2 腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞評(píng)估

利用R語言的limma包，對(duì)GC組織及正常組織轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的評(píng)估采用CIBERSORT算法，反卷積法處理標(biāo)記基因表達(dá)值，估算腫瘤組織中免疫細(xì)胞占比。這些免疫細(xì)胞包括M0 巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞等 22種。為提高準(zhǔn)確度，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行篩選，繪制所有符合條件的樣本中每種免疫細(xì)胞占比柱狀圖，免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖和GC組織與正常組織樣本免疫細(xì)胞占比的小提琴圖。

1.3 腫瘤組織中高含量免疫細(xì)胞的生存分析

結(jié)合從TCGA下載的患者臨床信息，合并免疫細(xì)胞矩陣和生存時(shí)間，對(duì)在腫瘤組織中含量顯著偏高的11種免疫細(xì)胞進(jìn)行批量化生存分析。根據(jù)免疫細(xì)胞水平中位值將患者分為高、低浸潤(rùn)組，采用Kaplan-Meier法計(jì)算其與生存的相關(guān)性，使用R語言的survival包繪制生存曲線。

1.4 WGCNA 模塊構(gòu)建及可視化

WGCNA技術(shù)是一種為分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)而建立的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法。相較于一維分子生物學(xué)的研究方法，其構(gòu)建的基因模塊幾乎覆蓋了人類的所有基因，對(duì)生物系統(tǒng)的展示更加精準(zhǔn)。本研究利用R語言中WGCNA包進(jìn)行了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言進(jìn)行初步篩選，去除離群值以保證可信度，然后繪制樣本層次聚類樹，并依據(jù)差異基因表達(dá)譜定義相似度表達(dá)矩陣，對(duì)基因進(jìn)行相似性度量。

具體而言，用Sij表示基因i和基因j的表達(dá)相似度，通過皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，Pcc）計(jì)算獲得相關(guān)系數(shù)Sij=|cor（i,j）|。由此構(gòu)成相似度矩陣S=[Sij]。對(duì)任意的兩個(gè)基因i、j之間的關(guān)聯(lián)，它們的臨接系數(shù)aij為aij= power（Xij,β）≡|Xij|β，即對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行次方的冪指數(shù)加權(quán)，得到軟閾值β。對(duì)最佳β值的選擇，應(yīng)當(dāng)使得R2值趨向于穩(wěn)定且R2＞0.8[18]。既遵循無尺度網(wǎng)絡(luò)原則，又確保不同模塊中基因間鏈接程度較高，以包含足夠的生物信息。采用拓?fù)渲丿B技術(shù)（Topological Overlap Measure, TOM）對(duì)衡量基因間的關(guān)聯(lián)性，將鄰接矩陣|Xij|轉(zhuǎn)換為拓?fù)渚仃嚘?|ωij|[19]?；騣和基因j之間若無直接相關(guān)關(guān)系,且又無第三方基因?qū)⑦@兩個(gè)基因間接連接起來，即視為兩個(gè)基因之間相關(guān)性為0（TOM=0），兩基因之間的差異度為（1-TOM）。基因之間的相關(guān)性不僅包括兩個(gè)相關(guān)系數(shù)，還包括第三方基因建立的相關(guān)性，所得結(jié)果與實(shí)際情況更加吻合，為共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

基于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的算法來完成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中模塊的識(shí)別。將每個(gè)模塊中基因最小數(shù)目定義為5 0，應(yīng)用基于層次的模塊識(shí)別，以差異度值（1-TOM）為基礎(chǔ)，使用動(dòng)態(tài)剪接法和聚類分析探測(cè)基因的功能模塊?；蛴蓸渲械娜~節(jié)點(diǎn)代表，密集連接的分支代表了接近的基因，函數(shù)“moduleEigengenes”計(jì)算得到的模塊特征基因（module eigengene，ME）為模塊的第一主成分，即該模塊基因表達(dá)譜代表。若模塊間的ME相關(guān)性＞0.75，則表示它們有類似的表達(dá)譜，應(yīng)將該模塊合并。將合并后的模塊與免疫細(xì)胞建立關(guān)聯(lián)分析，繪制模塊—免疫細(xì)胞相關(guān)熱圖，根據(jù)模塊中每個(gè)基因的基因與模塊之間相關(guān)性值（module membership，MM）和基因與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性絕對(duì)值（gene significance，GS）得到與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。

1.5 核心模塊中差異基因的生存分析

利用R語言survival包，分別對(duì)與靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的核心模塊中的差異基因進(jìn)行生存分析。依據(jù)GC組織中差異基因表達(dá)量中位數(shù)作為分界，根據(jù)基因表達(dá)量將患者分為高低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier、Log-rank法計(jì)算基因與患者總生存期的相關(guān)性，并使用R語言的survival包進(jìn)行生存曲線繪制，根據(jù)計(jì)算出的P＜0.05篩選差異生存基因。

1.6 基于外部數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證差異生存基因的預(yù)后意義

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行生存分析最權(quán)威的網(wǎng)站之一，包含了多個(gè)平臺(tái)的GC 數(shù)據(jù)，基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的關(guān)鍵基因的預(yù)后效能。通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了GSE84437，GSE57303，GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獨(dú)立數(shù)據(jù)集來驗(yàn)證關(guān)鍵基因的預(yù)后 意義。

1.7 差異生存基因的通路富集分析

為了注釋和分析生存差異基因的生物學(xué)功能，應(yīng)用基因本體論富集分析（geneontology enrichment analysis，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行途徑注釋和可視化，對(duì)P＜0.05的富集結(jié)果予以保留。其中GO分析分別選取生物過程（biological process，BP），細(xì)胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3大類展示富集結(jié)果；KEGG利用其全面的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，對(duì)基因信息對(duì)更高層次和更復(fù)雜細(xì)胞活動(dòng)以及生物體行為做出量化推測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 GC 中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞情況

在獲得的所有樣本中，有258例GC樣本和18例正常樣本符合CIBERSORT標(biāo)準(zhǔn)，即P＜0.05。在應(yīng)用CIBERSORT算法分析數(shù)據(jù)后，利用R語言作圖。首先，用一種顏色代表一種免疫細(xì)胞類型，用柱形的長(zhǎng)度代表一種類型免疫細(xì)胞的相對(duì)含量，各樣本不同類型免疫細(xì)胞的相對(duì)含量之和為1，繪制出了22種免疫細(xì)胞在每個(gè)樣本中的柱狀占比圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞（M0）、中性粒細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞等11種免疫細(xì)胞在腫瘤組織中明顯高于正常組織（圖1）。使用Pearson相關(guān)分析計(jì)算258例GC樣本中22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)度，繪制出每對(duì)免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖，紅色代表協(xié)同，藍(lán)色代表拮抗，相關(guān)性隨著顏色的加深而變高。在GC組織中，構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括：呈高負(fù)相關(guān)性的靜止記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞（r=-0.51），呈高正相關(guān)性的活化記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞（r=0.42）等（圖2）。用紅色和藍(lán)色代表GC組織和正常組織，橫坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的百分比，繪制GC及正常組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)占比小提琴圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，258例GC樣本和18例正常樣本的漿細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞等浸潤(rùn)程度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001、P=0.013、P=0.001、P=0.012），其中漿細(xì)胞在正常樣本組中的浸潤(rùn)程度較GC樣本組高，而靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞正常樣本組中的浸潤(rùn)程度低于GC樣本組（圖3）。

2.2 GC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與預(yù)后的關(guān)系

對(duì)于上述在腫瘤組織中含量顯著高于正常組織的11種免疫細(xì)胞，根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)值將患者分為高、低浸潤(rùn)組。采用Kaplan-Meier與Log-rank法進(jìn)行生存分析。最后發(fā)現(xiàn)靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況與GC患者生存率呈明顯相關(guān)（P=0.021、P=0.013）。其中靜止記憶性CD4 T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期短，而調(diào)節(jié)型T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期長(zhǎng)（圖4）。

圖1 所有標(biāo)本中22 種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖Figure 1 Histogram of the proportions of 22 immune cells in all specimens

圖2 GC 組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)圖Figure 2 Correlation diagram of the proportion of each immune cell in GC tissue samples

圖3 GC 及正常組織中免疫細(xì)胞占比小提琴圖Figure 3 Violin diagram of the proportion of immune cells in GC and normal tissues

圖4 免疫細(xì)胞構(gòu)成水平的Kaplan-Meier 生存曲線 A：靜止記憶性CD4 T 細(xì)；B：調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞Figure 4 Kaplan-Meier curves of different levels of immune cell composition A: T cells CD4 memory resting; B: T cells regulatory

2.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

在R語言中利用WGCNA包進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及可視化。首先對(duì)從樣本進(jìn)行去除離群值的層次聚類繪制，并匹配相應(yīng)的免疫細(xì)胞信息，從而將免疫浸潤(rùn)和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來。結(jié)果顯示，已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞，即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與基因模塊的匹配度均較好（圖5）。以0.9為cutoff值，選取β軟閾值為5 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，既保證網(wǎng)絡(luò)接近于無尺度網(wǎng)絡(luò)，又使其包含足夠的生物信息（圖6）。利用不同基因的相關(guān)性構(gòu)建分層聚類樹，通過動(dòng)態(tài)剪接法和聚類分析，將相似的基因歸類到同一模塊中，最終得到5個(gè)基因模塊，其中綠松石基因模塊的范圍最廣泛（圖7）。繪制熱圖對(duì)這5個(gè)基因模塊和不同類型的免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，每一行對(duì)應(yīng)一個(gè)模塊，每一列對(duì)應(yīng)一種免疫細(xì)胞，其中每一個(gè)單元對(duì)應(yīng)相關(guān)值?？梢园l(fā)現(xiàn)，綠松石模塊中的基因與已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞（r=0.27，P＜0.001）和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞（r=0.19，P=0.003）相關(guān)性最為顯著（圖8），因此將從綠松石模塊中篩選這兩類免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)調(diào)控基因。

圖5 樣本層次聚類樹結(jié)合免疫細(xì)胞表達(dá)量分析圖Figure 5 Analysis of sample level clustering combined with expression level of the immune cells

圖6 WGCNA 分析軟閾值（β）的確定Figure 6 Determination of soft threshold (β) for WGCNA analysis

圖7 GC 的共表達(dá)基因模塊聚類樹圖Figure 7 A cluster tree diagram of co-expressed gene modules for GC

圖8 熱圖分析模塊基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性Figure 8 Heat map analysis of the correlation between module genes and immune cells

2.4 GC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)預(yù)后基因的鑒定

對(duì)與記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的綠松石模塊基因進(jìn)行生存分析。為了縮小與疾病無關(guān)的死亡因素的干擾，本數(shù)據(jù)集將長(zhǎng)于10年的生存期默認(rèn)為10年，并將患者的生存狀態(tài)設(shè)為存活。最后共分析了355例GC患者的總生存期，共鑒定得到了3個(gè)與記憶性CD4 T細(xì)胞相關(guān)（CGB5、LINC00106、LINC00392）和一個(gè)與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)（UPK1B）的生存基因（均P＜0.05），其中CGB5、LINC00392、UPK1B的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，而LINC00106的高表達(dá)則有益于患者預(yù)后（圖9）。

2.5 差異生存基因的預(yù)后驗(yàn)證

基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)CGB5、UPK1B的高表達(dá)均與GC的不良預(yù)后明顯相關(guān)（P＜0.05）。通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載GSE84437,GSE57303，GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獨(dú)立數(shù)據(jù)集，驗(yàn)證篩選出的關(guān)鍵基因的預(yù)后意義，生存分析發(fā)現(xiàn)CGB5和UPK1B的表達(dá)與G C 患者的預(yù)后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），證明了其具有可靠的預(yù)后相關(guān)性。然而，由于包含LINC00106和LINC00392的數(shù)據(jù)集在現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄過少且樣本數(shù)目明顯不足，我們僅發(fā)現(xiàn)LINC00106的高表達(dá)與GC的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.251）。利用lnCAR（https://lncar.renlab.org），基于多組GEO數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，LINC00106在GC等消化道腫瘤中均呈低表達(dá)，而LINC00392在GC等消化道腫瘤中均呈高表達(dá)，這與先前的發(fā)現(xiàn)一致，并在一定程度上反映了兩者在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用（圖10）。

2.6 基因的功能富集分析

對(duì)得到的4 個(gè)預(yù)后差異基因執(zhí)行包括G O 和KEGG途徑在內(nèi)的功能分析。GO富集分析通過對(duì)差異基因進(jìn)行GO terms富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)算出差異基因FDR值（q-value），最后按照BP，MF和CC 3個(gè)層面對(duì)基因進(jìn)行注釋和排序。GO分析表明：這些基因主要參與的生物過程包括：肌肉系統(tǒng)過程、細(xì)胞器裂變、DNA?結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶II?特異性和糖胺聚糖結(jié)合，主要的CC有：細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集于細(xì)胞周期和血管平滑肌收縮過程（圖11）。

圖9 Kaplan-Meier 法分析4 個(gè)關(guān)鍵基因?qū)C 患者預(yù)后的影響Figure 9 Kaplan-Meier analysis of the impact of the 4 key genes on the prognosis of GC patients

圖10 4 個(gè)關(guān)鍵基因在外部數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)后效能驗(yàn)證Figure10 Prognostic efficacy verification of 4 key genes in external databases

圖11 預(yù)后相關(guān)基因的GO 和KEGG 功能富集分析 A：GO 途徑；B：KEGG 途徑Figure 11 Functional enrichment analysis of GO and KEGG based on prognostic related genes A: GO pathway; B: KEGG pathway

3 討 論

GC是全球范圍內(nèi)人類最高發(fā)的惡性腫瘤之一，但由于前期癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)腫瘤已經(jīng)發(fā)展到中晚期[1]，且治療后后期復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后效果較差，致死率居高不下[20]。近年來，腫瘤的免疫學(xué)治療受到極大的關(guān)注[21]。GC腫瘤微環(huán)境高度復(fù)雜且異質(zhì)，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[22]，其浸潤(rùn)的類型和比例與患者臨床結(jié)局密切相關(guān)[23]。因此探究免疫細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)改善GC患者的預(yù)后具有重要意義[24]。

本研究首先通過CIBERSORT算法，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者的詳細(xì)臨床信息，篩選出了浸潤(rùn)情況與GC患者生存率呈顯著相關(guān)的兩類免疫細(xì)胞，即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞。靜止記憶性CD4 T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中有重要作用[25]，但在腫瘤進(jìn)展中的意義尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)其浸潤(rùn)程度與生存呈負(fù)相關(guān)，可為后續(xù)研究提供參考。對(duì)于調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXP3的高表達(dá)顯示了GC良好的預(yù)后，這與本研究發(fā)現(xiàn)的高調(diào)節(jié)型T細(xì)胞浸潤(rùn)預(yù)示著GC更有利的預(yù)后一致。WGCNA作為一種高可信度的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法，已成為鑒定疾病相關(guān)基因最可靠的方法之一。Huang等[27]基于WGCNA發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與GC患者的預(yù)后相關(guān)的基因，有望將其作為GC治療靶標(biāo)。Jiang等[28]利用WGCNA構(gòu)建了1個(gè)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物。然而根據(jù)對(duì)既往文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)尚未有GC方面的研究將WGCNA用于浸潤(rùn)免疫細(xì)胞相關(guān)預(yù)后基因的鑒定。本研究創(chuàng)新性地將CIBERSORT算法與WGCNA結(jié)合，基于高通量表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，探索基因網(wǎng)絡(luò)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)聯(lián)，挖掘出了與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。并通過生存分析鑒定出4個(gè)GC預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)控基因（CGB5、LINC00106、LINC00392、UPK1B）。

在這些被篩選出的差異預(yù)后基因中，已有研究表明CGB5和UPK1B在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用。CGB5 在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和某些非滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中異常表達(dá)，可以獨(dú)立預(yù)測(cè)晚期GC患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率不良；并能促進(jìn)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成，有望為卵巢癌的治療提供新的靶標(biāo)和思路[29-30]。UPK1B 在膀胱癌中上調(diào)，與膀胱癌的腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。它通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，然而目前UPK1B在GC機(jī)制中的作用尚不明確[31]。而基因LINC00106、LINC00392尚無研究顯示與腫瘤相關(guān)。因此，這些基因在消化道腫瘤中的潛在作用以及它們參與的生物學(xué)功能與腫瘤之間的聯(lián)系需要全面研究。

本研究回顧性地基于已經(jīng)完成的國(guó)外公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了分析，但由于患者信息獲取不全，一些患有感染、免疫系統(tǒng)疾病或服用抗炎藥的患者也有可能被納入了這項(xiàng)研究，從而干擾了免疫浸潤(rùn)分析。此外，WGCNA算法本身在獲取基因間相互作用信息時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和甲基化存在依賴，也使本研究仍有一定的局限性。由于現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄過少，本研究尚未完整地驗(yàn)證LINC00106和LINC00392表達(dá)與GC患者預(yù)后的關(guān)系，其作用還有待后續(xù)進(jìn)一步分析鑒定。

總之，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用合理的生物信息方法，在兩類與GC生存率密切相關(guān)的免疫細(xì)胞中鑒定出了4個(gè)與GC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)預(yù)后基因，揭示了腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞是GC預(yù)后的重要因素，為GC的早期診斷和治療以及免疫療法研究和新靶向藥的開發(fā)提供了分子依據(jù)。