黃楠楠，王鍇華，陳珊，孫爽，楊德強(qiáng)，張春晶，都曉偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

山藥來自于薯蕷科植物薯蕷，從中醫(yī)學(xué)的角度講，其性平，味甘，能補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)腎澀精、生津益肺，是中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的藥食同源類中藥的一種[1-3]。山藥的藥理作用多樣，其可以通過藥材中含量最高的山藥多糖起到降血糖的作用并且可以進(jìn)一步的調(diào)節(jié)血脂[4-6]，還可調(diào)節(jié)脾胃抑制胃排空和血清淀粉酶的分泌，增強(qiáng)小腸的吸收作用[7]，并且山藥可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，從而起到免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等藥理作用[8-9]。

糖尿病被認(rèn)為是同冠心病一樣危險(xiǎn)的疾病。30%以上的糖尿病患者都有不同程度的心肌功能損傷，并漸漸的發(fā)展成為糖尿病心肌病(DCM)[10]。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制有很多，作用也很復(fù)雜，涉及鈣離子的處理、氧化應(yīng)激、胰島素的代謝信號(hào)異常、葡萄糖毒性、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等[11]。糖尿病心肌病可以引起患者心臟病變，心肌代謝紊亂，心肌細(xì)胞變大增殖從而導(dǎo)致心肌肥大等不良癥狀[12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是產(chǎn)生于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的概念，其目的是改良和完善藥理學(xué)的相關(guān)研究，使其更加多樣的一種方法。其認(rèn)為藥物不是只作用于一個(gè)靶點(diǎn)，而是通過多靶點(diǎn)間的相互作用產(chǎn)生效果，同中藥的思想不謀而合。所以通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來分析中藥活性成分的藥理作用，可以為該領(lǐng)域提供很大幫助[13-14]。

關(guān)于山藥治療糖尿病心肌病的研究，大多都是將山藥作為復(fù)方中的一味藥材，通過復(fù)方整體來研究糖尿病心肌病的治療，例如山茱萸與山藥配伍可以保護(hù)小鼠心肌[15]。同時(shí)，有多位學(xué)者證明，山藥及相關(guān)藥材和提取物具有很好的抗氧化和清除自由基的作用[16-17]。并且還有學(xué)者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了山藥能明顯降低糖尿病小鼠心肌組織內(nèi)過氧化脂質(zhì)含量[18]，這也就證明了山藥能保護(hù)心肌組織。本篇文章主要探討關(guān)于山藥治療糖尿病心肌病的作用機(jī)制，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘山藥治療糖尿病心肌病的重要成分及其作用的靶點(diǎn)和通路，體現(xiàn)中藥在治療慢性疾病中的優(yōu)勢(shì)，為今后中藥活性物質(zhì)研究做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 山藥活性成分的收集和篩選

經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研，本次論文中山藥的活性成分來自于TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，https://tcmspw.com/index.php)數(shù)據(jù)庫[19]。該數(shù)據(jù)庫可以捕捉藥物、疾病、靶點(diǎn)之間的關(guān)系，并且可以檢索中藥及其活性成分，是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中常用數(shù)據(jù)庫之一。根據(jù)其研究特性和具體情況，對(duì)檢索出的活性成分進(jìn)行篩選，以參數(shù)OB%(口服利用度)≥30%、DL(類藥性)≥0.18為限制條件，篩選出山藥的活性成分。

1.2 山藥活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫是一款能提供蛋白質(zhì)序列及其功能的數(shù)據(jù)庫，包含了多個(gè)物種，檢索時(shí)選用的是Reviewed(已證明)和Humam(人類)物種來增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可信度[20]。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫尋找山藥活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，在Uniport數(shù)據(jù)庫尋找山藥活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因名稱，將其轉(zhuǎn)換，以便后續(xù)分析和探討。

1.3 糖尿病心肌病靶點(diǎn)的收集

糖尿病心肌病的靶點(diǎn)則是利用OMIM[21](Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)“Diabetic cardiomyopathy”進(jìn)行檢索，經(jīng)去重、取并集后得到糖尿病心肌病的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.4 交集基因的獲取

將篩選出的山藥活性成分靶點(diǎn)基因和糖尿病心肌病的疾病靶點(diǎn)基因取交集，并利用在線網(wǎng)站(http://en.findeen.com/venny2.0.html)Venny繪制Venn圖，得到交集靶點(diǎn)。

1.5 “山藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

Cytoscape軟件(Version3.7.2)是一款利用圖形化的方法顯示網(wǎng)絡(luò)并且可以對(duì)網(wǎng)絡(luò)中各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的分析以及編輯的軟件，將符合要求的山藥的活性成分轉(zhuǎn)換成為相應(yīng)的簡(jiǎn)稱，并將活性成分和糖尿病心肌病共有的靶點(diǎn)導(dǎo)入其中，構(gòu)建山藥活性成分和糖尿病心肌病的“山藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

PPI(protein-protein interaction)為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，選出前文所提到的中藥活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)，使用STRING分析這些基因的相互作用關(guān)系，可以得到關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白質(zhì)互作圖。STRING(https://string-db.org/)是一個(gè)可以獲取已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。交互包括直接和間接關(guān)聯(lián)，它們的證據(jù)主要源于計(jì)算預(yù)測(cè)，生物之間的知識(shí)轉(zhuǎn)移以及其他數(shù)據(jù)庫的交互作用。

1.7 生物通路分析與功能富集

DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫有著一套全面的功能注釋工具，其功能全面，可以了解大量基因背后的生物學(xué)含義[22-23]。將疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，選擇智人物種，并在基因列表下方點(diǎn)擊“OFFICE_GENE_SYMBOL”識(shí)別和“Gene List”然后進(jìn)行分析。分析完畢后，分別選擇通路中的KEGG分析和GO生物富集分析，依據(jù)信息和數(shù)據(jù)，利用在線作圖工具微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)做出KEGG氣泡圖和三種GO分析的水平條狀圖，最終根據(jù)數(shù)據(jù)和表格分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行討論。

2 結(jié)果

2.1 山藥活性成分及其靶點(diǎn)信息

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫的檢索，共檢索出符合參數(shù)OB%≥30%、DL≥0.18為限制條件的成分共計(jì)16種，靶點(diǎn)142個(gè)，經(jīng)過去重，刪去無效靶點(diǎn)之后共得山藥活性成分靶點(diǎn)69個(gè)，詳細(xì)信息見表1。

表1 山藥活性成分基本信息

2.2 糖尿病心肌病靶點(diǎn)獲取

通過OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫的尋找，經(jīng)過取并集后去重，得到疾病靶點(diǎn)3 922個(gè)。

2.3 交集基因的獲取

將得到的糖尿病心肌病的靶點(diǎn)與山藥活性成分的靶點(diǎn)利用在線作圖軟件取交集，得到疾病靶點(diǎn)3 922個(gè)約占總基因數(shù)的98.3%，山藥活性成分的69個(gè)靶點(diǎn)約占總基因數(shù)的0.6%，交集基因47個(gè)約占總基因數(shù)的1.2%，并且得到Venn圖，見圖1。圖中Drug代表山藥活性成分的靶點(diǎn)，Disease代表糖尿病心肌病的靶點(diǎn)。

圖1 山藥活性成分靶點(diǎn)與糖尿病心肌病靶點(diǎn)Venn圖

2.4 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

利用Cytoscape軟件對(duì)篩選出的47個(gè)靶點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)的10個(gè)活性成分作圖，得到節(jié)點(diǎn)59個(gè)，連線140個(gè)。圓形代表中藥材山藥，八邊形代表山藥的活性成分，菱形代表交集靶點(diǎn)，圓角正方形代表疾病糖尿病心肌病，網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，網(wǎng)絡(luò)圖詳細(xì)信息(見表2)。其中表2的度值與對(duì)應(yīng)節(jié)點(diǎn)連線的數(shù)量成正比。

圖2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖詳細(xì)信息

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的繪制以及關(guān)鍵靶點(diǎn)

利用STRING對(duì)47個(gè)交集基因進(jìn)行相互作用分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制山藥活性成分及糖尿病心肌病的交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，根據(jù)度值篩選中位數(shù)11得到25個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.6 KEGG通路分析

將疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中后，分析導(dǎo)出數(shù)據(jù)，共有通路63條，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行COUNT>3的篩選得到數(shù)據(jù)，應(yīng)用在線工具繪制KEGG通路氣泡圖(見圖4)。圖中X軸表示山藥活性成分和疾病交集基因的富集情況，Y軸表示與治療糖尿病心肌病相關(guān)的KEGG通路，圖中氣泡顏色越紅越亮就表示靶點(diǎn)的P值越小，氣泡面積越大表示通路上的靶點(diǎn)越多。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

由圖可知，鞘脂信號(hào)通路(Sphingolipid signaling pathway)、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)通路(Adrenergic signaling in cardiomyocytes)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)和PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)等是治療的主要信號(hào)通路。

2.7 GO富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫給出的結(jié)果中選擇GO-BP、GO-CC、GO-MF 3種GO富集分析，分別得到170、27和60條信息，按照KEGG的篩選標(biāo)準(zhǔn)(COUNT>3)得到130個(gè)結(jié)果，對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理運(yùn)用在線作圖工具繪制3種GO分析的水平條形圖，見圖5。

圖中X軸為P值的負(fù)對(duì)數(shù)，Y軸代表各個(gè)通路的名稱，藍(lán)色數(shù)據(jù)為GO-BP分析，淺藍(lán)色為GO-CC分析，橙色為GO-MF分析，整體水平條形圖按照P值由大到小分類排列，經(jīng)過整理得到與糖尿病心肌病相關(guān)的生物過程，如氧化還原酶活性、氧化還原過程、凋亡過程的負(fù)調(diào)控過程等。

3 討論

中藥成分多樣而復(fù)雜，在其發(fā)揮藥理作用時(shí)通常會(huì)作用于身體的多個(gè)靶點(diǎn)，參與不同的信號(hào)通路和生物過程從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。本研究是首次利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究單味中藥山藥對(duì)治療糖尿病心肌病的作用機(jī)制，并且在這基礎(chǔ)上構(gòu)建了“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，從多個(gè)角度出發(fā)，探究山藥治療糖尿病心肌病的作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路和生物進(jìn)程，從而以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度闡述其作用機(jī)制。

Sun X等研究發(fā)現(xiàn)花旗松素可以過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在體內(nèi)和體外預(yù)防糖尿病性心肌病[24]，而在本次研究中經(jīng)過GO-BP分析發(fā)現(xiàn)了與抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的生物過程oxidoreductase activity、oxidation-reduction process、negative regulation of apoptotic process等，說明了山藥治療糖尿病心肌病的生物進(jìn)程。

圖5 GO富集分析水平條形圖

薯蕷皂苷元在治療糖尿病及其并發(fā)癥中有著重要的作用[25-26]。在糖尿病治療中其可以通過IRS-1、PI3K-Akt信號(hào)通路減弱高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪對(duì)胰島素的抵抗力[27]。Wei Q等利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌模型進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元可以通過NO-sGC-cGMP-PKG通路調(diào)節(jié)小鼠的心肌細(xì)胞[28]。本實(shí)驗(yàn)通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)cGMP-PKG是山藥治療糖尿病心肌病的重要通路，與實(shí)驗(yàn)相符。Pi W X發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元也可通過利用減少大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡來預(yù)防高糖誘導(dǎo)的心肌損傷，與前文所敘述的花旗松素機(jī)制類似[29]。除此之外，薯蕷皂苷元還可以通過MicroRNAs等途徑[30-31]來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡作用。

在酪氨酸代謝中，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元還有抑制酪氨酸酶的作用[32-33]，而在糖尿病心肌病中，酪氨酸代謝也是重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[34-36]，關(guān)于其相關(guān)機(jī)制，還有待研究。

綜上所述，經(jīng)數(shù)據(jù)分析山藥含有的薯蕷皂苷元和花旗松素可能是治療糖尿病心肌病的主要活性成分，推測(cè)其分別通過AKT1、NOS3、TP53、VEGFA、TP53等核心靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt、cGMP-PKG以及MicroRNAs等主要途徑來誘導(dǎo)高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞凋亡來防止心肌細(xì)胞肥大，從而治療糖尿病心肌病。

本研究為系統(tǒng)開展山藥治療糖尿病心肌病的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為中藥治療糖尿病心肌病及其相關(guān)藥物靶點(diǎn)的研究提供了新的研究思路和方法。但由于數(shù)據(jù)庫更新時(shí)間問題，有些山藥的活性成分還未被添加到數(shù)據(jù)庫中，并且其作用靶點(diǎn)尚未明確，治療糖尿病心肌病的作用靶點(diǎn)也不斷更新之中，而且，由于藥物吸收的多樣性，并不是所有活性成分和所有治療都是利用口服的方式吸收藥物，除此之外，藥物的首過效應(yīng)也會(huì)一定的影響，以上這些因素都會(huì)致使本研究具有一定的局限性。同時(shí)，由于中藥中化學(xué)成分復(fù)雜，山藥多作為食品應(yīng)用于日常生活中，這就導(dǎo)致其活性成分的提取方法有所不同，最終達(dá)到的治療效果也不同。這些問題有待于后續(xù)進(jìn)行更為深入的分析和驗(yàn)證。