李璐，梁永林,2*，安冬，毛慧芳，葛開發(fā)，李東頂，薛進旭

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

“陽中求陰”是張景岳基于陰陽互根互用關(guān)系認識所創(chuàng)立的治療腎陰虛證的原則，正如張景岳言：“陰陽之理，原自互根，彼此相須，缺一不可。無陽則陰無以生，無陰則陽無以化”[1]，因此，在治療陰陽虛損疾患時應(yīng)根據(jù)陰陽損傷之主次，因陰虛而損陽者，應(yīng)補陰而化陽；因陽虛而損及陰者，應(yīng)補陽而生陰[2]。故《景岳全書·新方八陣略》所言：“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮……以精氣分陰陽，則陰陽不可離。”左歸丸作為“陽中求陰”的代表方，充分體現(xiàn)張氏“陽中求陰，陰得陽升則泉源不竭”的補腎原則。相關(guān)研究表明[3-4]，腎陰虛證與能量代謝相關(guān)。那么，左歸丸治療腎陰虛證的作用機制是否與能量代謝有關(guān)？能量代謝對腎陰虛證有什么影響？基于此，本實驗采用灌胃甲狀腺素與利血平混合懸浮液制備腎陰虛大鼠動物模型，將左歸丸拆分為滋陰藥與補陽藥，并運用左歸丸對其進行干預(yù)，觀察線粒體能量代謝在左歸丸組、滋陰組及補陽組干預(yù)下的變化規(guī)律，論證左歸丸“陽中求陰”配伍作用機理。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物實驗室。飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，12 h光照和夜循環(huán)，自由飲水?dāng)z食。SPF級動物質(zhì)量合格證號：SCXK(甘)2015-0001。

1.2 藥品及試劑

1)左歸丸配伍組:熟地黃24 g，枸杞12 g，山藥12 g，山茱萸12 g，龜板膠(醋龜板)12 g，鹿角膠(鹿角霜)12 g，川牛膝9 g，菟絲子12 g。2)滋陰組：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，龜板膠(醋龜板)12 g，川牛膝9 g。3)補陽組：菟絲子12 g，鹿角膠(鹿角霜)12 g。以上中藥材均采購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房,飲片質(zhì)量經(jīng)過鑒定符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。將上述各配伍組的藥物總重量(g)與水(mL)的比例定為1∶10，由于含有先煎的藥物(鹿角霜、醋龜板)，所以先取總水量20%的水先煎30 min，同時將其余藥物加總水量的50%進行浸泡30 min，然后將先煎的藥物總量放入浸泡后的藥物用武火待煮沸后調(diào)至文火保持微沸30 min，過濾，取剩余30%的水量與過濾殘渣進行混合，立刻進行第2次煎煮，用武火煮沸后調(diào)至文火保持微沸30 min然后過濾。將2次濾液進行混合，將其濃縮至含生藥1 g/mL，4 ℃恒溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

甲狀腺素片(山東省惠諾藥業(yè)有限公司，H37020075)；復(fù)方利血平片(山西云鵬制藥有限公司，H14023921)；Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(5424R)；酶標(biāo)儀(iMark)；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9022)；超低溫冰箱(DW-HL528)；電鏡修塊機(EM TRIM2)；電鏡切片機(EM UC7)；電鏡采圖機(HT7700)。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組

SPF級雄性SD大鼠56只，按照隨機分組原則分為對照組8只和模型組48只，適合性飼養(yǎng)1周后，模型組大鼠灌胃甲狀腺素片(7.5 mg/100 g)和利血平(0.08 mg/100 g)，二者混合為2 mL的混懸液，每日1次，觀察2周[5]，制備腎陰虛證大鼠模型，造模成功后隨機分為模型組、滋陰組、補陽組和左歸丸組。

模型評價：模型組大鼠出現(xiàn)肛溫升高，體質(zhì)量增長緩慢或體質(zhì)量下降，自主活動量增多，毛發(fā)干枯，不易抓取，飲水量增加，且血清中cAMP/cGMP比值升高為造模成功[6]。

2.2 藥物干預(yù)

參考李儀奎主編的《中藥藥理實驗方法學(xué)》及人與動物體表面積換算系數(shù)計算給藥劑量，再依據(jù)預(yù)實驗給藥方法與劑量得出：左歸丸組按照生藥劑量9.45 g/kg灌胃，滋陰組按照生藥劑量為7.29 g/kg灌胃，補陽組按照生藥劑量2.16 g/kg灌胃，灌胃體積均為7.5 mL/kg，對照組及模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次。

2.3 指標(biāo)采集與檢測

大鼠末次給藥后禁食過夜后,腹腔注射10%水合氯醛溶液，按0.3 mL/100 g的劑量對大鼠進行麻醉，待麻醉生效后，快速取下肝臟組織，放入PBS緩沖液(提前預(yù)冷制備)中洗去殘余血液，然后用過濾紙把殘留在肝組織表面的PBS緩沖液吸干凈，用剪刀將放置于預(yù)冷的燒杯中的肝臟在冰浴上剪碎成泥狀，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃均漿器，勻漿。將勻漿液離心，3 000 rpm，10 min，提取上清，除去脂肪類物質(zhì)，沉淀即為粗制線粒體[7]。用酶標(biāo)法檢測Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量的變化，透射電鏡下觀察肝組織中線粒體結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 模型評價

與對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)暴躁不安、喜動、飲水量增加、形體消瘦、肛溫升高、毛發(fā)干枯、不易抓取、大便干燥等這些癥狀與體征，并且檢測血清中cAMP/cGMP比值顯著性升高(P<0.01)；表明制備腎陰虛證動物模型成功。見表1。

表1 對照組和模型組cAMP/cGMP比值的比較

3.2 各組實驗大鼠肛溫及體質(zhì)量變化情況比較

與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)肛溫升高，體質(zhì)量降低，自主活動量增多，毛發(fā)干枯，不易抓取，飲水量增加，且差異顯著(P<0.01)。與模型組相比，左歸丸組情況有所改善接近對照組，效果優(yōu)于滋陰組與補陽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與左歸丸組比，滋陰組效果優(yōu)于補陽組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2、3，見圖1、2。

表2 各組實驗大鼠肛溫變化情況比較

表3 各組實驗大鼠體質(zhì)量變化情況比較

圖1 各組實驗大鼠肛溫變化

圖2 各組實驗大鼠體質(zhì)量變化

3.3 各組實驗大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量的變化

與對照組比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，左歸丸組上述指標(biāo)明顯下降且療效優(yōu)于滋陰組與補陽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，與左歸丸組比較，Na+-K+-ATPase、SDH活性及ATP含量滋陰組較接近，補陽組欠佳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而LDH、CCO活性滋陰組、補陽組與左歸丸組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 各組大鼠Na+-K+-ATPase、LDH、SDH、CCO活性及ATP含量變化情況比較

3.4 透射電鏡下觀察肝線粒體結(jié)構(gòu)變化

對照組線粒體結(jié)構(gòu)清晰，嵴排列整齊，膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體數(shù)量多。與對照組相比，模型組線粒體發(fā)生明顯腫脹，嵴排列紊亂斷裂消失，膜結(jié)構(gòu)不完整；與模型組相比，滋陰組與補陽組線粒體結(jié)構(gòu)較完整，嵴排列較為整齊，膜結(jié)構(gòu)較正常。左歸丸組效果較好，膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴數(shù)量增加清晰可見。見圖3。

圖3 肝組織電鏡下線粒體圖片(×7000)

4 討論

腎陰虛大鼠表現(xiàn)出暴躁不安、喜動、飲水量增加、形體消瘦、肛溫升高、毛發(fā)干枯、不易抓取、大便干燥等這些癥狀與體征與現(xiàn)代研究認為腎陰虛時基礎(chǔ)代謝增強，產(chǎn)熱及能量水平升高，反應(yīng)興奮等虛熱癥狀等癥狀一致[8]。

中醫(yī)理論認為，“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”，內(nèi)寄元陰元陽，陰陽二者可相互資生，正如《素問·生氣通天論》言:“陰者，藏精而起亟也；陽者，衛(wèi)外而為固也”[9],說明陰陽互根，精氣互生，《黃帝內(nèi)經(jīng)》又言: “陽為氣，陰為味。味歸形，形歸氣，氣歸精，精歸化；精食氣，形食味，化生精，氣生形。味傷形，氣傷精；精化為氣，氣為陽，陽必生于陰；精為陰，陰必生于陽。所以精之與氣，本自互生”[10]，《難經(jīng)》認為左腎為腎屬水主陰，右腎為命門屬火主陽。梁永林教授基于“三陰三陽”開闔樞理論從人體氣機運行角度對腎陰虛證進行解讀，認為子時始，以少陰為樞，左腎樞厥陰心包、少陽三焦至太陰肺，此腎氣運行以肝木系統(tǒng)為途徑，午時始，以少陽三焦為樞，右腎樞太陽膀胱闔于陽明大腸，此時陽氣右降于右腎(相火)，相火源于腎而寄生于肝。正如葉天士云：“肝者，將軍之官，相火寄內(nèi)”[11]。相火藏于腎水中，所以在左腎陰的作用下，右腎陽才不上浮， 若左腎陰水不足，陰不斂陽，右命門相火妄動，以三焦為樞，可傳交至三焦心包，導(dǎo)致三焦與心包火旺，出現(xiàn)心煩急躁、陰虛火旺等癥狀，又因虛火宜補不宜瀉，因此在治療腎陰虛證時通過滋腎陰涵右腎陽，滋陰以制約右腎陽的上浮而導(dǎo)致的三焦、心包火旺。故針對腎陰虛證時，陰津蒸化之源,重在溫補腎陽, 激發(fā)命門之火，使陽氣蒸發(fā),命火升動，陰液上騰四布，陰虧自復(fù)[12]。因此，左歸丸“陽中求陰”配伍當(dāng)以滋陰(熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞、龜板膠、川牛膝)為主，同時適當(dāng)輔以扶陽(菟絲子、鹿角膠)之品，使補陰而不抑敗真火，育陰以涵陽。通過觀察本實驗，表明滋陰組與補陽組因無法完全降低線粒體能量代謝相關(guān)酶活性及修復(fù)線粒體膜結(jié)構(gòu)，未完全改善機體能量代謝狀態(tài)。而左歸丸全方組治療效果接近對照組，充分體現(xiàn)張氏“陽中求陰，陰得陽升則泉源不竭”的補腎原則，進一步體現(xiàn)了“陽中求陰”的配伍價值。

本實驗采用甲狀腺素及利血平誘導(dǎo)腎陰虛證造模成功后，運用酶聯(lián)免疫法、透射電鏡等探究腎陰虛證時線粒體能量代謝的變化，大鼠肝線粒體出現(xiàn)能量代謝障礙，表現(xiàn)在肝線粒體酶活性及ATP含量升高，左歸丸組可降低腎陰虛大鼠SDH、CCO、LDH、Na+-K+-ATPase的酶活性，保證三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的正常進行，改善腎陰虛癥狀，表明左歸丸可通過調(diào)節(jié)肝線粒體酶活性改善機體能量代謝，可能是左歸丸治療腎陰虛證的機制之一， 由于線粒體膜結(jié)構(gòu)損傷會導(dǎo)致呼吸鏈無法進行電子的傳遞與三羧酸循環(huán)的正常進行，左歸丸通過改善模型組大鼠線粒體病理結(jié)構(gòu)，修復(fù)線粒體膜結(jié)構(gòu)，改善能量代謝，表明左歸丸可通過恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)機體能量代謝水平，這可能也是左歸丸治療腎陰虛證的機制之一。

綜上所述，本實驗從線粒體能量代謝角度出發(fā)，從微觀角度探討中醫(yī)藥治療能量代謝異常的作用機理，并且通過觀察比較左歸丸拆方組(滋陰組、補陽組)大鼠肝線粒體酶活性與線粒體結(jié)構(gòu)的變化，證實左歸丸“陽中求陰”理論的臨床意義與價值，更進一步證實腎陰虛證與線粒體能量代謝之間的相關(guān)性，期對今后以線粒體作為靶點探討疾病的治療機理提供科學(xué)的實驗依據(jù)。