王雪，夏順利，劉景楠，凌佳音，王秋蘭，林麗，韓濤

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

白花蛇舌草系茜草科耳草屬植物白花蛇舌草[Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb. ]的干燥全草，別名蛇舌草、尖刀草、羊須草等，是一種傣族藥物，見于《廣西中藥志》[1]，性味為苦、甘、寒，具有清熱解毒、消癰、利濕通淋之功效。白花蛇舌草是2015版《中國藥典》中收錄的花紅顆粒、抗骨髓炎片、炎寧糖漿等制劑中的配方中藥之一[2],臨床常用于毒蛇咬傷、咽喉腫痛、保護(hù)肝損傷、治療惡性腫瘤等[3-4]。目前，白花蛇舌草注射液治療癌癥發(fā)熱已經(jīng)取得了較好的臨床效果[5]。據(jù)報(bào)道[6]，白花蛇舌草含蒽醌類、黃酮類、萜類、甾醇類、有機(jī)酸類等多種活性成分，其總黃酮具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫功能及抗氧化等藥理作用[7-9]。

本研究對5種不同性能的樹脂D-101、AB-8、NKA-9、HDP-826及聚酰胺進(jìn)行篩選，以吸附、解析效果為指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗(yàn)考察大孔樹脂純化總黃酮的工藝參數(shù)(上樣質(zhì)量濃度、上樣體積、上樣體積流量、洗脫劑濃度、洗脫體積、洗脫劑體積流量)，篩選出最佳的純化工藝，并考察純化后白花蛇舌草總黃酮對MFC荷瘤小鼠的抑瘤作用，以期為后續(xù)相關(guān)抗腫瘤機(jī)制的研究及臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物、瘤株及動物

白花蛇舌草，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)林麗老師鑒定為茜草科白花蛇舌草[Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb.] 的干燥全草(產(chǎn)地：河南駐馬店，留存樣本于生藥標(biāo)本室)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，批號：B20771)；小鼠前胃癌細(xì)胞(Mouse forestomach carcinoma，MFC；上海富衡生物科技有限公司)；雄性C57BL/6小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量16～18 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 試劑及儀器

大孔吸附樹脂D-101、AB-8、NKA-9、HPD-826樹脂、聚酰胺(柱層析用，60～90目，江蘇常州市長豐化工有限公司)；無水乙醇(天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純)；三氯化鋁(天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純)；RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone，Lot No.AE29456629)；PBS(HyClone，Lot No.AF29449009)；胎牛血清(Lot No.504103119，Yeasen Biotech Co.,Ltd)；胰蛋白酶(Lot No.T6912580，Yeasen Biotech Co.,Ltd)；注射用環(huán)磷酰胺(CTX，國藥準(zhǔn)字H32020857，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；微量紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600，島津企業(yè)管理有限公司)；電子天平(EX2202ZH/E，奧豪斯儀器有限公司)；分析天平(BS224S，生物實(shí)驗(yàn)中心)；超聲波清洗器(KH3200，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(V-700，步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-DⅢ，甘肅宜平儀器有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma 371)；超凈工作臺(CJ-2S，天津市泰斯特儀器有限公司)；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(上海量具刃具廠有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取前期實(shí)驗(yàn)所得的白花蛇舌草總黃酮浸膏0.32 g于燒杯中，加蒸餾水適量，超聲處理10 min，使其充分溶解，抽濾后即得澄清供試品溶液，備用。

2.2 總黃酬含量測定方法

參考文獻(xiàn)[10]，以蘆丁為對照品，采用三氯化鋁比色法測定白花蛇舌草總黃酮含量。精密稱取蘆丁對照品0.010 0 g, 加95%乙醇適量，超聲加熱溶解后，以95%乙醇定容至100 mL搖勻，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

顯色劑配制:取三氯化鋁約1.00 g，精密稱定，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，得到1%三氯化鋁溶液，備用。

最大吸收波長的確定：移取供試品溶液、蘆丁對照溶液各3 mL于10 mL容量瓶中，加入4 mL 1% 的三氯化鋁溶液，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。同法制備空白液。在300～ 500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄紫外可見吸收光譜，選擇400 nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL至10 mL容量瓶，加入4 mL 1% AlCl3溶液，95%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min。于400 nm處測定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到線性回歸方程y=28.718x-0.011 9，r=0.999 5，蘆丁在0.005～0.035 mg/mL范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

總黃酮含量的測定：精密量取3.0 mL的樣品液于10 mL的容量瓶中，按照“2.2”項(xiàng)操作，測定并計(jì)算總黃酮的含量。

2.3 大孔吸附樹脂的篩選

2.3.1 樹脂的預(yù)處理

3倍體積95%乙醇浸泡24 h充分溶脹，用95%乙醇沖洗，至醇液加水不產(chǎn)生渾濁為止，再用純化水洗至無醇味，備用。儲存用95%乙醇浸泡，臨用前用純化水沖洗至中性，即可使用[11-12]。

2.3.2 樹脂型號的篩選

通過靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)，優(yōu)選樹脂型號D101、AB-8、NKA-9、HPD-826以及聚酰胺，共計(jì)5種。

2.3.2.1 靜態(tài)吸附

準(zhǔn)確稱取2.0 g經(jīng)預(yù)處理的樹脂放入具塞三角瓶中，加入30 mL的樣品溶液，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)2 h，然后靜置24 h，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層液測定總黃酮濃度，按下面公式計(jì)算各樹脂室溫下的吸附量以及吸附率：

2.3.2.2 靜態(tài)解吸附

靜態(tài)吸附后的樹脂過濾抽干，加40 mL 95%乙醇解吸附，恒溫振蕩器上振蕩24 h，過濾，測定濾液中白花蛇舌草總黃酮含量，計(jì)算解吸率：

以上公式中，C0表示供試品溶液初始的總黃酮濃度(mg/mL)；C1表示吸附后上清液中剩余的總黃酮濃度(mg/mL)；V1表示供試品溶液的體積(mL)，m表示樹脂重量(g)；C2表示解吸液的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

表1 不同樹脂的性能及對白花蛇舌草總黃酮的吸附解吸情況(n=3)

通過靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)比較，由表1可知在5種類型的樹脂中，AB-8型樹脂和HPD-826型樹脂對白花蛇舌草總黃酮的吸附性能相當(dāng)，吸附量分別為0.161 5、0.162 5 mg/g；吸附率分別為77.46%、77.94%；D-101、NKA-9吸附率分別為74.34%、74.58%，其中D-101解吸率最高為97.49%，其解吸率RSD值為2.71%(n=3)。綜合以上數(shù)據(jù)，5種樹脂吸附性能相差不大，D101型樹脂解吸性能更好，且回收率達(dá)最高72.47%，因此選擇D-101型大孔吸附樹脂用于白花蛇舌草總黃酮的純化。

2.3.3 D-101樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)行為曲線

通過靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)篩選出最佳樹脂D-101作為純化樹脂，進(jìn)一步考察D-101樹脂對白花蛇舌草總黃酮靜態(tài)吸附動力學(xué)行為。準(zhǔn)確稱取該樹脂5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加樣品溶液50 mL，每30 min振搖2 min，靜置。每隔1 h吸取上清液約2 mL測定總黃酮含量，至吸附飽和停止測定，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出靜態(tài)吸附曲線。由圖1可知，D-101樹脂對白花蛇舌草總黃酮的吸附為快速平衡型，4～5 h基本達(dá)到平衡，表現(xiàn)出良好的靜態(tài)吸附動力學(xué)特性，適用于白花蛇舌草總黃酮純化。

2.3.4 D-101樹脂洗脫劑濃度的考察

將“2.4.2”項(xiàng)下的飽和吸附后樹脂過濾、抽干，各稱取0.5 g于100 mL錐形瓶中，分別加入20 mL不同體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、95%的乙醇作為解吸劑，振蕩搖勻，24 h后測定總黃酮含量。由圖2可知，乙醇濃度在30%～80%之間，總黃酮質(zhì)量濃度逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到95%時(shí)，總黃酮質(zhì)量濃度開始降低，因此選擇80%的乙醇為解吸液。

圖1 D-101樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮質(zhì)量濃度的影響

2.4 D-101大孔樹脂動態(tài)吸附工藝參數(shù)考察

2.4.1 上樣質(zhì)量濃度對D-101樹脂吸附率的影響

準(zhǔn)確稱取等份經(jīng)過預(yù)處理的D-101樹脂，每份(濕) 5.0 g，分別濕法裝入(2 cm×30 cm)具閥色譜柱中，精確加入質(zhì)量濃度分別為0.312、0.936、1.560、 2.184、2.808 mg/mL的供試品溶液各30 mL，以2 mL/min的流速上樣，測定總黃酮含量，計(jì)算吸附率。由圖3可知，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為2.184 mg/mL時(shí)，吸附率最高為77.54%，因此選擇2.184 mg/mL為最佳上樣質(zhì)量濃度。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對吸附率的影響

2.4.2 上樣體積流量

取已預(yù)處理好的樹脂5.0 g，上樣液為30 mL(2.184 mg/mL)，以不同流速(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min)上樣，測定吸附后總黃酮的含量，計(jì)算吸附率。由圖4可知，吸附率隨上樣體積流量先增大后降低，當(dāng)流速為4 mL/min時(shí)吸附率又上升，達(dá)到最大值81.33%，因此選擇上樣體積流量為4 mL/min。

圖4 上樣體積流量對吸附率的影響

2.4.3 泄露曲線的繪制

取已處理好的D-101樹脂5.0 g(BV=4.71 mL)，采用濕法裝柱，將供試品溶液配制成質(zhì)量濃度為2.184 mg/mL時(shí)上樣，流速為4 mL/min，同時(shí)收集流出液，每5 mL收集1份洗脫液，并分別測定總黃酮，以流出液體積為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線。當(dāng)流出液中總黃酮質(zhì)量濃度為上樣液總黃酮質(zhì)量濃度的1/10時(shí)，到達(dá)泄露點(diǎn)，認(rèn)為此時(shí)為最佳上柱體積[13]。由圖5可知，在流出液達(dá)到15 mL時(shí)吸光度急劇增加，表明總黃酮開始泄露；當(dāng)達(dá)到80 mL時(shí)，總黃酮質(zhì)量濃度基本不再增加，表明樹脂對總黃酮的吸附已達(dá)到平衡。因此，上樣體積選為80 mL。

圖5 上樣體積對總黃酮質(zhì)量濃度的的影響

2.4.4 水洗體積

上樣吸附的過程中，有水溶性雜質(zhì)及多糖吸附在樹脂上，因此用蒸餾水洗脫已達(dá)到吸附平衡的樹脂柱，每10 mL收集1份洗脫液，測定每份樣品吸光度，直至吸光度趨于穩(wěn)定，以吸光度對樣品份數(shù)作圖，繪制水洗脫曲線。由圖6可知，當(dāng)水洗脫液收集至第5份(50 mL)時(shí)，吸光度基本趨于穩(wěn)定，說明水溶性雜質(zhì)基本沖洗干凈，因此水洗體積為50 mL。

圖6 水洗脫液對吸光度的影響

2.4.5 洗脫液乙醇體積

上樣完成后，先用50 mL蒸餾水沖洗雜質(zhì)及多糖，然后用80%乙醇進(jìn)行洗脫，每5 mL收集1份洗脫液。共收集20份，測定洗脫液吸光度，以吸光度對洗脫份數(shù)作圖，繪制乙醇洗脫曲線。由圖7可知，當(dāng)乙醇體積收集到第10份(50 mL)時(shí)，吸光度基本趨于零，說明總黃酮已洗脫完全。因此，醇洗體積為50 mL。

圖7 醇洗脫液對吸光度的影響

2.4.6 醇洗脫劑體積流量

按上述吸附條件平行上樣5份，用50 mL蒸餾水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，然后用50 mL 80% 乙醇分別以1.0、2.0、3. 0、4. 0、5. 0 mL/min的體積流量洗脫，收集洗脫液，測定吸光度，計(jì)算解吸率。由圖8可知，洗脫體積流量為4 mL/min時(shí)，解析率達(dá)最大，因此醇洗脫液體積流量為4 mL/min。

圖8 醇洗脫液體積流量對解吸率的影響

3 最佳工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證最佳工藝的可行性與穩(wěn)定性，按照優(yōu)選出的工藝條件：選擇D-101樹脂，上樣質(zhì)量濃度為2.184 mg/mL，上樣體積為80 mL，樹脂的上樣量為16 mL/g，上樣體積流量為4 mL/min，水洗脫體積為50 mL，醇洗脫為80%乙醇，洗脫體積為50 mL，洗脫體積流量為4 mL/min，反復(fù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，濃縮洗脫液至干，稱其質(zhì)量，平均干重為0.05 g，純品占粗提物質(zhì)量的28.62%，純度為57.5%左右。

純度(%)=C×V/M×100%

其中,C：純化后質(zhì)量濃度(mg/mL)；V：黃酮溶液體積(mL)；M：黃酮物質(zhì)干重(g)。

4 白花蛇舌草總黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用

4.1 模型建立、分組及給藥

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在常規(guī)條件(37 ℃、飽和濕度、5%CO2) 下培養(yǎng)MFC胃癌細(xì)胞至對數(shù)生長期，平均細(xì)胞密度為5.34×105個/mL。C57BL/6小鼠右側(cè)腋下經(jīng)75%乙醇消毒后，接種0.2 mL MFC細(xì)胞懸液，5～6 d右腋下肉眼可見腫節(jié)，待腫瘤生長至5 mm×5 mm左右則表明模型建立成功。將模型小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性組(環(huán)磷酰胺)及白花蛇舌草總黃酮高、中、低劑量組，10只/組。另設(shè)10只空白組作對照。給藥前記錄小鼠體質(zhì)量(給藥前體質(zhì)量)，模型組、空白組灌胃生理鹽水，陽性組腹腔注射環(huán)磷酰胺 (25 mg/kg) ，白花蛇舌草總黃酮高、中、低劑量組灌胃白花蛇舌草總黃酮 (200、100、50 mg/kg)，1次/d，連續(xù)給藥8 d。

4.2 腫瘤生長曲線

從接種MFC細(xì)胞第7天(即給藥第1天)開始，在第7、8、9、11、13、15天分別用游標(biāo)卡尺測量并計(jì)算腫瘤體積(TV)。

TV=a×b2/2

其中,a、b分別表示腫瘤長徑、短徑。以平均TV值繪制腫瘤生長曲線，見圖9。

圖9 白花蛇舌草總黃酮干預(yù)后的腫瘤生長曲線

4.3 抑瘤率及臟器指數(shù)測定

末次給藥24 h后，記錄小鼠體質(zhì)量(給藥后質(zhì)量)。頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離腫瘤組織及脾臟，精確測量質(zhì)量及瘤體長徑、短徑。

抑瘤率=[(模型組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量) /模型組瘤質(zhì)量]×100%

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

結(jié)果如表2所示，與模型組相比，陽性組和白花蛇舌草總黃酮高劑量組小鼠瘤體積、瘤重顯著性降低；中、低劑量組瘤重均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，說明白花蛇舌草總黃酮具有一定的抑瘤作用，高、中、低劑量組抑瘤率分別為66.6%、60.09%、47.36%。與模型組比較，陽性組體質(zhì)量、脾臟指數(shù)顯著降低，說明化療藥環(huán)磷酰胺具有一定的免疫抑制作用;白花蛇舌草總黃酮高劑量組顯示出良好的抗腫瘤活性(P<0.05或P<0.01)，對MFC荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，其機(jī)制可能通過增強(qiáng)免疫機(jī)能發(fā)揮抗腫瘤作用。

表2 白花蛇舌草總黃酮對MFC荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)及抑瘤作用的影響

5 討論

為盡可能提取出白花蛇舌草總黃酮并不破壞其性質(zhì)，前期實(shí)驗(yàn)以酶法-超聲提取，選用纖維素-果膠-木蛋白酶，乙醇濃度為60%、酶量為0.7%、酶解時(shí)間為90 min、料液比為1:25(g/mL)時(shí)，提取方法經(jīng)中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選，白花蛇舌草總黃酮提取率最高，為1.95%。近年來，大孔吸附樹脂在中藥提取分離及純化中的研究和應(yīng)用日益增多[14]。本研究通過穩(wěn)定性高、操作簡單的三氯化鋁法[10]，結(jié)合紫外分光光度計(jì)測定白花蛇舌草總黃酮含量，考察D-101、AB-8、HPD-826、NKA-9以及聚酰胺樹脂在不同條件下對總黃酮的吸附率和解吸率，不同樹脂極性有所差異，故其吸附和解吸性能不同。研究結(jié)果顯示，D-101型大孔樹脂對白花蛇舌草總黃酮具有較好的純化富集作用，具體工藝參數(shù)如下：選用D-101型大孔樹脂，上樣質(zhì)量濃度為2.184 mg/mL，上樣體積為80 mL，樹脂的上樣量為16 mL/g，上樣體積流量為4 mL/min，水洗脫體積為50 mL，醇洗脫為80%乙醇，洗脫體積為50 mL，洗脫體積流量為4 mL/min，所得精制品中總黃酮純度達(dá)57.5%左右，且操作簡便、回收率高。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，純化后白花蛇舌草總黃酮具有良好的抗腫瘤活性，可明顯抑制MFC荷瘤小鼠瘤體的生長及提高體質(zhì)量及脾臟指數(shù)，提示白花蛇舌草總黃酮可能通過改善免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用，其具體機(jī)制還需后期繼續(xù)研究。