郝若祎，耿雪，徐世一，蘇慧，張新宇，李雪瑩，霍元子,王琪,閻雪瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

三氧化二砷 (arsenic trioxide,ATO),分子式為As2O3,為礦物質砒霜的主要成分。由于As2O3對急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)及其他惡性血液腫瘤具有良好的療效[1]，因此其對其他實體腫瘤的影響也引起了研究者們的廣泛興趣。大量實驗結果證實，As2O3對不同組織來源的實體腫瘤，包括人舌鱗癌細胞Tca8113[2]等，具有抑制增殖并促進細胞凋亡的作用。

聚乳酸(PLA)因良好的生物可降解性和相容性已經成為藥劑學領域研究最多的載體材料之一[3-5]。Tang 等[6]采用共沉淀法制備了一種膽酸- 聚乳酸-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(CA-PLA-TPGS)嵌段共聚物，載藥后制成粒徑100 nm左右納米粒，在抑制乳腺癌細胞方面顯示出良好效果。聚乙二醇(PEG)具有突出的物理化學性能和生物性能,主要表現在親水性、在水和有機溶劑中的可溶性、無毒、無抗原性和免疫性[7]。此外,聚乙二醇抗生物游積的作用，能減少細胞和蛋白非特異性吸附。通過將親水基團引入聚乳酸的端基中,得到的改性聚乳酸既保留了其原來的可生物降解性和良好的力學性能,又改善載體材料的親水性,生物親和性。經聚乙二醇修飾的聚乳酸進入人體后，毒副反應更小、且能有效逃避免疫防御系統(tǒng)的吞嚼作用，使聚乳酸成為優(yōu)良的藥物載體材料。

將藥物制備成被載體包裹的納米粒，會提高對腫瘤細胞多藥耐藥的逆轉作用[8]，對納米粒表面進行親水基團修飾，可改善藥物體內生物過程[9-12]。本研究選擇As2O3為模型藥物，以聚乳酸、聚乙二醇修飾的聚乳酸為載體材料制成納米粒，并比較納米粒在體外對乳腺癌細胞MCF-7/ADR藥效作用的異同[13-17]，以及對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR耐藥倍數的逆轉[18-22]。為納米給藥系統(tǒng)提供參考，同時也為臨床增加高效低毒的治療藥物奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 細胞株

MCF-7細胞株(獲贈于黑龍江中醫(yī)藥大學中藥化學實驗室)；MCF-7/ADR細胞株(上海攬寶儀器設備有限公司)。

1.1.2 主要試劑與藥品

三氧化二砷原料藥(Merck Parmstadt)；三氧化二砷聚乳酸納米粒凍干粉(本實驗室自制)；F1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)；胰蛋白酶消化液(BiLLab公司)；Hoechst 33342熒光染色液(碧云天生物技術有限公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 主要儀器

潔凈工作臺(WT-1ND型)；氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(鄭州南北儀器設備有限公司，HF-90型)；倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司，Axio型)；酶標儀(美國熱電儀器有限公司，MK3型)；低速臺式離心機(TDL-4型，上海安亭科學儀器廠)；流式細胞儀(美國BD Accui C5)。

2 方法

2.1 納米粒凍干粉的制備

2.1.1 As2O3-PLA-NPs凍干粉的制備

采用復乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒，精密稱量PLA 40 mg，加入1.5 mL乙酸乙酯，超聲至完全溶解。精密吸取濃度為30 mg/mL的As2O3溶液100 μL，100 W超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)，將初乳加入到6 mL含6%吐溫20的外水相中，80 W冰浴超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)形成復乳，以旋轉蒸發(fā)法除去有機溶劑，以去離子水轉移至25 mL容量瓶中，定容至刻度線，即為As2O3-PLA-NPs樣品。

按體積比1∶1加入5%甘露醇作為凍干保護劑，分裝于西林瓶中，預凍處理后，在-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍24 h，取出，再放在冷凍干燥機中干燥約48 h，即可得納米粒凍干粉。

2.1.2 As2O3-mPEG -PLA-NPs納米粒凍干粉的制備

采用復乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒，精密稱量mPEG-PLA 40 mg，其他步驟同“2.1.1”。

2.2 三氧化二砷納米粒細胞毒性研究

2.2.1 細胞生長曲線的繪制

細胞以2×104個/mL 密度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL，共21瓶。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h取出3瓶，先在倒置顯微鏡下觀察細胞生長范圍，然后用含0.25 %胰蛋白酶的消化液消化，用完全培養(yǎng)基終止消化后，1 000 r/min離心5 min，用 5 mL 培養(yǎng)基調成細胞懸液，分別計數，取3次計數平均值。計數連續(xù)7 d的細胞數目。根據細胞計數結果，以單位細胞數(萬/mL)為縱坐標，以時間(D)為橫坐標繪制生長曲線。

2.2.2 三氧化二砷游離藥及納米粒的細胞毒性研究

取對數生長期的MCF-7/ADR細胞，胰酶消化，離心后，用培養(yǎng)基稀釋，細胞計數使得細胞密度在1×104個/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，當細胞生長到亞融合狀態(tài)時，進行相應藥物處理。將As2O3原料藥用1 mol/L的NaOH溶解，以1 mol/L HCl調節(jié)至中性，配成濃度為100 μmol/L的As2O3溶液，再加培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。藥物分組：As2O3組，As2O3-PLA-NPs溶液組，As2O3-mPEG-PLA-NP溶液組，以及空白納米粒載體組，每組均設1、2、4、8、16 μmol/L5個濃度，每個濃度設6個復孔。對照組加同體積的空白培養(yǎng)基。向96孔板最外側孔內添加PBS溶液，加入藥物后，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48 h后終止培養(yǎng)，在每孔加入20 μL CCK-8試液，培養(yǎng)4 h后，在酶標儀450 nm波長下測定吸光值。根據測定的吸光值，計算抑制率。

增值抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

2.3 采用流式細胞儀檢測不同As2O3- NPs對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響

2.3.1 細胞樣品的制備

選取對數生長期的MCF-7/ADR 細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為 3×105個/mL，用 6 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng) MCF-7/ADR細胞，每孔接種2 mL單細胞懸液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后吸棄舊培養(yǎng)液。每孔分別加入含4、8、16 μmol/L的As2O3、As2O3-PLA、As2O3-mPEG-PLA納米粒的培養(yǎng)基分散液，對照組加等量培養(yǎng)基，每個濃度3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

2.3.2 細胞樣品的處理

將細胞培養(yǎng)液吸至5 mL離心管中，PBS洗滌貼壁細胞1次，加入1 mL胰酶細胞消化液消化細胞。室溫孵育至輕輕調打細胞可以脫落時，停止消化，吸除胰酶消化液。加入離心管內細胞液，混均，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數。取3×105個/mL重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，每孔分別加入195 μL Annexin V-FITC結合液、5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫25 ℃避光孵育15～20 min，隨后置于冰浴中。用鋁箔包裹避光,隨即進行流式細胞儀檢測。

2.4 Hoechst染色觀察As2O3納米粒對細胞凋亡的作用

取對數生長期的MCF-7/ADR細胞，用胰蛋白酶消化后，調整細胞密度為3×105個，接種于6孔板，每孔分別加入含4、8、16 μmol/L的As2O3、As2O3-PLA、As2O3-mPEG-PLA納米粒的培養(yǎng)基分散液，對照組加等體積培養(yǎng)基，每個濃度3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

每個樣品收集約100萬細胞于15 mL離心管內，離心棄上清液。用1.0 mL細胞染色緩沖液重懸細胞。加入5 μL Hoechst33342染色液，混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，檢測前離心沉淀細胞，用PBS緩沖液洗滌2次，使用倒置顯微鏡觀察藍色熒光。

2.5 As2O3-NPs對MCF-7/ADR細胞周期的影響

2.5.1 細胞樣品的制備

將MCF-7/ADR細胞接種于6孔板中，每孔接種2 mL單細胞懸液(3×105個/mL)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液。各孔分別加入2 mL藥物濃度為8 μmol/L的As2O3-PLA-NP、As2O3-mPEG-PLA-NP培養(yǎng)液，對照組加等體積As2O3游離藥培養(yǎng)液；為了考察空白納米粒對細胞周期的影響，增設同濃度空白納米粒組，每一個濃度設3個復孔，分別于加藥后48 h收集細胞。小心收集細胞培養(yǎng)液到15 mL離心管內備用。用胰酶消化液消化細胞，至細胞輕輕吹打可以脫落停止消化，用槍頭將細胞吹落下來，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，混懸均勻，收集到一個離心管內,1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液,加入約1 mL PBS重懸，并轉移到5 mL離心管內，再次離心沉淀細胞。

2.5.2 細胞固定

加入1 mL預冷的70%乙醇，輕輕吹打混均，4 ℃固化12 h。固化完成后，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞。小心吸除上清，加入1 mL冰浴預冷的PBS溶液，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，輕輕彈擊離心管底，防止細胞成團。

2.5.3 細胞染色

在每管細胞樣品中，加入染色緩沖液6 mL，碘化丙啶染色液(20×)300 μL，RNase A(50×)120 μL，混合均勻。每管細胞樣品中，加入0.5 mL配制好的碘化丙啶染色液，輕輕混懸細胞，37 ℃避光孵育30 min。通過流式細胞儀，檢測不同藥物納米粒對MCF-7/ADR的細胞周期作用結果。

2.6 CCK-8法測定藥物對MCF-7多藥耐藥細胞株耐藥的逆轉

將MCF-7和MCF-7/ADR分為5組，分別為MCF-7組、MCF-7/ADR組、MCF-7/ADR+As2O3組、MCF-7/ADR+As2O3-PLA-NP組和MCF-7/ADR+As2O3-mPEG-PLA-NP組。以上各組分別加入濃度為0.04、0.4、4、40、400 μmol/L的阿霉素。

用CCK-8法測定MCF-7和耐藥細胞MCF-7/ADR對化療藥物ADM的敏感性。取對數生長期細胞用胰酶消化后用培養(yǎng)液制成單細胞懸液，細胞計數，以每孔1×104個細胞接種到96孔板上，每孔體積為100 μL。細胞貼壁后，用細胞培養(yǎng)液配制不同濃度梯度的藥物培養(yǎng)細胞，對照組為不含藥物普通培養(yǎng)基。給藥濃度分別為0.04、0.4、4、40、400 μmol/L，每組設6個復孔。藥物作用24 h后，吸除培養(yǎng)液。每孔加入100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基、20 μL CCK-8于5%CO2，37 ℃孵育0.5 h，終止培養(yǎng)。選擇波長490 nm，在酶標儀上測定各孔的OD值并記錄實驗結果。計算各藥物對細胞的半數抑制濃度(IC50)、耐藥倍數及逆轉倍數。

lgIC50=lg最大劑量-lg(最大劑量/相臨計量)[陽性反應率之和-(3-最大陽性反應率-最小陽性反應率)/4]

耐藥倍數=(耐藥細胞)/(親本細胞)×100%

逆轉倍數=逆轉前MCF-7/ADR細胞IC50值/逆轉后MCF-7/ADR細胞IC50值

3 結果

3.1 細胞生長曲線的繪制

連續(xù)培養(yǎng)7 d，細胞計數結果見表1，繪制細胞生長曲線，呈“S”型，見圖1。

表1 流式細胞儀計數法細胞計數

圖1 MCF-7/ADR細胞生長曲線

3.2 三氧化二砷游離藥及納米粒的細胞毒性結果

As2O3組、As2O3-PLA-NPs組、As2O3-mPEG-PLA-NPs組所計算的抑制率結果如表2～表4所示?？瞻准{米粒PLA-NPs、mPEG-PLA-NPs組所計算的抑制率結果如表5和表6。根據結果可知，給藥組對細胞毒性作用呈濃度-時間依賴性，隨著給藥濃度及作用時間增加，藥物對細胞毒性增強。各組與對照組比較，濃度大于2 μmol/L時，抑制率有顯著差異，作用48 h后，各組抑制率明顯提高。As2O3-PLA-NPs含藥濃度為4 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為18.38%和25.86%；As2O3-mPEG-PLA-NPs含藥濃度為4 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為22.40%和26.44%；As2O3-PLA-NPs含藥濃度為16 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為51.65%和70.35%；As2O3-mPEG-PLA-NPs含藥濃度為16 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為64.04%和85.41%；空白納米粒對細胞抑制率實驗表明各給藥組抑制率均小于10%，證明納米粒載體安全無毒，不會干擾實驗結果。

表2 As2O3組對MCF-7/ADR的抑制結果

表3 As2O3-PLA-NPs組對MCF-7/ADR的抑制結果

表4 As2O3-mPEG-PLA-NPs組對MCF-7/ADR的抑制結果

表5 PLA-NPs空白納米粒不同時間抑制率結果

表6 mPEG-PLA-NPs空白納米粒不同時間抑制率結果

3.3 As2O3-PLA-NPs對MCF-7/ADR細胞凋亡的結果

通過流式細胞儀檢測計算出4、8、16 μmol/L 3個濃度時，三氧化二砷納米粒分別誘導MCF-7/ADR凋亡48 h后，細胞在早晚期凋亡率，見圖2、表7。

3.4 Hoechst熒光染色納米粒對細胞凋亡的作用結果

用倒置顯微鏡觀察藍色熒光，結果見圖3。由圖觀察得，隨給藥劑量增加，凋亡細胞增多；納米粒組凋亡多于游離藥物組，mPEG組48 h凋亡結果強于PLA組。

注：A、E、I分別為對照組；B、C、D分別為4 μmol/L的 As2O3、As2O3 -PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs ；F、G、H 分別為8 μmol/L的 As2O3、As2O3 -PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs ；J、K、L分別為16 μmol/L的 As2O3、As2O3 -PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs。圖2 48 h各組藥物不同濃度下對MCF-7細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果

表7 三氧化二砷及其納米粒誘導MCF-7/ADR凋亡結果

注：A、E、I分別為對照組；B、C、D分別為4 μmol/L的 As2O3、As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs ；F、G、H分別為8 μmol/L的 As2O3、As2O3 -PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs ；J、K、L分別為16 μmol/L的As2O3、As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs。圖3 不同濃度As2O3、As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs對細胞凋亡的熒光染色

3.5 As2O3- NPs對MCF-7/ADR細胞周期的影響

通過流式細胞儀，檢測不同藥物納米粒對MCF-7/ADR的細胞周期作用結果，見表8、圖4。不論游離藥物組還是納米粒組，均阻滯細胞于G2/M期，所占細胞平均比例As2O3為26.48%，為31.37%，As2O3-mPEG-PLA-NP為35.79%，各組均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.6 CCK-8法測得各組細胞的半數抑制率、耐藥倍數和逆轉倍數

通過CCK-8實驗，在波長450 nm下測定ADM對人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR的吸光度值(OD)，根據公式計算抑制率，結果見表9。

注：A為陰性對照組；B、C分別為PLA、mPEG-PLA空白納米粒；D為As2O3游離藥物組，E為As2O3-PLA-NP；F為As2O3-mPEG-PLA-NP。圖4 原料藥及納米粒對MCF-7/ADR的細胞周期作用結果

表8 原料藥及納米粒對MCF-7/ADR的細胞周期作用結果

表9 ADM對MCF-7、MCF-7/ADR細胞抑制作用結果

利用公式計算得出，ADM對MCF-7細胞IC50為12.59 μmol/L，對MCF-7/ADR細胞IC50為70.79 μmol/L，耐藥倍數為5.62。

根據“2.2.2”得到的納米粒對細胞毒性結果及實驗分組，用藥物濃度為1 μmol/L的As2O3、As2O3-PLA-NP、As2O3-mPEG- PLA-NP聯(lián)合ADM，作用于MCF-7/ADR，ADM對MCF-7/ADR的IC50降低。當用As2O3、As2O3-PLA-NP、As2O3-mPEG-PLA-NP作逆轉劑時，ADM對MCF-7/ADR的IC50分別為56.63、39.33、33.55 μmol/L；逆轉倍數分別為1.32、1.80、2.11。結果見表10。

表10 ADM對細胞MCF-7/ADR的IC50及其逆轉倍數(n=6)

4 討論

本實驗分別對游離藥物、兩組載藥納米粒對MCF-7/ADR細胞毒性、凋亡、周期的作用進行了實驗研究。比較了游離三氧化二砷、三氧化二砷納米粒對人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR體外細胞生長的影響，各項結果顯示，經PEG修飾的納米粒子對抗耐藥細胞的效果更顯著。采用Annexin V/FITC-PI凋亡試劑盒考察了不同濃度三氧化二砷納米粒對細胞的生長抑制作用，發(fā)現三氧化二砷納米粒腫瘤細胞的抑制呈濃度和時間依賴性，As2O3-PLA-NPs含藥濃度為16 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為51.65%和70.35%；As2O3-mPEG-PLA-NPs含藥濃度為16 μmol/L時，24 h和48 h對細胞生長的平均抑制率分別為64.04%和85.41%，較PLA組顯著提高(P<0.05)。細胞周期實驗則發(fā)現，各給藥組均阻滯細胞于G2/M期，所占細胞平均比例As2O3為26.48%，As2O3-PLA-NP為31.37%，As2O3-mPEG-PLA-NP為35.79%，各組件均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。用As2O3、As2O3-PLA-NP、 As2O3-mPEG-PLA-NP分別作逆轉劑時，逆轉倍數分別為1.32、1.80、2.11，As2O3-mPEG-PLA-NP效果最好。

綜上所述，PLA為載體的納米粒，作用效果強于游離藥物，且隨藥物劑量的增加，對癌細胞的抑制效果也提高；經PEG修飾的聚乳酸載體，顯示出更好的抗癌細胞作用效果。可能是由于藥物被包裹載體材料后，增加了對細胞膜的親和性，使藥物更容易被細胞所攝取，而PEG的修飾，可以提高這種親和作用，使藥物更容易被細胞攝取，從而提高其抗腫瘤效果。對于增強凋亡的具體可能機制，還需通過進一步的實驗進行研究。