韓 超，胡貝貞，胡 俠，王石磊，沈 燕，雷美康

(1.浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院,浙江杭州 310015；2.紹興海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江紹興 312000；3.聯(lián)勤保障906醫(yī)院，浙江溫州 325000；4.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016)

克霉唑為咪唑類廣譜抗真菌藥，是治療真菌感染疾病的合成抗菌藥，對多種真菌尤其是白色念珠菌具有較好的抗菌作用[1,2]。以往藥品中克霉唑的測定主要采用的是高效液相色譜法[3 - 6]，但由于藥品基體復雜，采用液相色譜法測定缺乏克霉唑分子量信息，在定性方面存在不足，影響含克霉唑藥物的質(zhì)量控制。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定克霉唑報道較少，且主要集中在環(huán)境和食品中的克霉唑殘留檢測[7,8]。氣相色譜-質(zhì)譜法具有分析時間短、分離效果好、定性準確等優(yōu)勢，已經(jīng)在相關(guān)藥品質(zhì)量控制中得到了廣泛應(yīng)用[9 - 12]。

本文建立氣相色譜-質(zhì)譜法測定藥品中克霉唑的含量，同位素內(nèi)標法定量，方法快速、簡便、準確，可用于含克霉唑藥品的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，安捷倫公司)；Elma P 300 H超聲波清洗器(德國，Elma公司)；MS3 basic渦旋振蕩器(IKA公司)；分析天平(梅特勒-托利多公司)。

克霉唑標準品(純度99.9%，CAS23593-75-1)由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH提供，克霉唑-d5(純度99.0%)由加拿大CDN公司提供。丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷均為色譜純(美國Fisher Scientific)。

1.2 標準溶液配制

取克霉唑標準品10 mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100 μg/mL克霉唑標準儲備溶液。取克霉唑-d5標準品1 mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100 μg/mL克霉唑-d5標準儲備溶液。用乙腈逐級稀釋，配成0.05、0.1、0.2、1.0、5.0 μg/mL的系列濃度標準曲線溶液，其中克霉唑-d5同位素內(nèi)標溶液濃度均為0.2 μg/mL。

1.3 樣品制備

1.3.1 含有克霉唑的片劑、乳膏和凝膠樣品制備和提取取一片含有克霉唑的片劑用水溶解并定容至500 mL；稱取1.0 g含有克霉唑的乳膏，含有克霉唑的凝膠取一支，分別用水溶解并定容至30 mL。各取1 mL上述液體，加入5 mL乙腈提取，再加入1 g NaCl鹽析，靜置分層，移取乙腈層至10 mL刻度離心管中，下層再加入5 mL乙腈進行提取，合并提取層于10 mL刻度離心管中并用乙腈定容至10 mL。取上述定容液10 μL于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5標準儲備溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待測樣品溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.3.2 含有克霉唑的栓劑樣品制備和提取取含有克霉唑的栓劑一枚，用乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1,V/V)溶解并定容至100 mL。取10 μL上述液體，置于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5標準儲備溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待測樣品溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.3.3 含有克霉唑的溶液樣品的制備和提取取1 mL含有克霉唑的溶液，加甲醇稀釋并定容至10 mL。取10 μL上述液體，于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5標準儲備溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待測樣品溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 氣相色譜條件DB-35 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫：初溫60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。載氣為氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min，進樣口溫度260 ℃，不分流進樣，進樣量1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源溫度300 ℃，傳輸線溫度310 ℃，四極桿溫度180 ℃，溶劑延遲5 min。EI電離模式，電離能70 eV。監(jiān)測模式：全掃描(SCAN)和選擇離子監(jiān)測(SIM)模式同時進行，SCAN掃描范圍m/z50～400，SIM監(jiān)測離子m/z165、243、278，其中定量離子為m/z165，克霉唑-d5監(jiān)測離子m/z170、248、283，其中定量離子為m/z283。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

圖1 克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)的全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan mass spectrograms of clotrimazole(A) and clotrimazole-d5(B)

在EI電離源下，對10 mg/L的克霉唑及克霉唑-d5標準溶液分別進行一級質(zhì)譜全掃描，得到每個目標物的全掃描譜圖，見圖1。選擇豐度最強的三個離子作為定性離子，選擇豐度最強的離子作為定量離子，克霉唑定性離子為m/z165.1、243.2、278.1，定量離子為m/z165.1；克霉唑-d5定性離子為m/z170.1、248.2、283.1，定量離子為m/z283.1。選擇離子監(jiān)測譜圖見圖2。

圖2 0.2 μg/mL的克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)標準溶液的選擇離子色譜圖Fig.2 Selective ion mode chromatograms of clotrimazole(A) and clotrimazole-d5(B) standard solution(0.2 μg/mL)

2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)不同藥品類型，分別采用不同溶劑進行快速有效提取。不同類型的藥劑(片劑、溶液、乳膏、栓劑、凝膠)含有不同的輔料，需要用不同的溶劑先溶解樣品以獲得澄清的液體，使所含的克霉唑均勻分布在溶劑中，才能進行下一步的提取。本實驗根據(jù)不同類型的藥劑，選取了含克霉唑的片劑、溶液、乳膏、栓劑、凝膠5種常見的藥品，根據(jù)其所含的輔料不同，選取水、甲醇或乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1,V/V)預(yù)溶解樣品。采用有機溶劑溶解的樣品經(jīng)乙腈稀釋一定倍數(shù)后直接供氣相色譜-質(zhì)譜測定，采用水溶解的樣品用乙腈反萃取其中的克霉唑，然后稀釋一定倍數(shù)后供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系取“1.2”方法制備的0.05、0.1、0.2、1.0、5.0 μg/mL系列標準工作溶液進行上機測定，以克霉唑與克霉唑-d5的峰面積比值為縱坐標(Y)，克霉唑與克霉唑-d5的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(X)繪制標準曲線，同位素內(nèi)標法定量。結(jié)果表明，在0.05～5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，克霉唑線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=0.285+2.364X，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9997。

2.3.2 穩(wěn)定性考察取同一份樣品溶液，在室溫下放置0、4、8、16、24 h后進氣相色譜-質(zhì)譜分析，測定峰面積，克霉唑峰面積的相對標準偏差(RSD)為4.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 精密度試驗取按照“1.2”方法制備克霉唑標準品溶液，分別配制成高、中、低3種不同濃度(5、0.2、0.05 μg/mL)的溶液，按照“1.4”氣相色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，克霉唑峰面積的RSD為4.6%。

2.3.4 重復性試驗精密稱取同一批片劑藥品6份，按照“1.3”方法制備供試品溶液，分別進行氣相色譜-質(zhì)譜測定，RSD為4.2%，表明重復性良好。

2.3.5 回收率與精密度對各個類型樣品進行加標回收率實驗，結(jié)果見表1。測得克霉唑的回收率在91.1%～97.2%之間，RSD為3.8%～6.5%。

表1 加標回收率和RSD結(jié)果

2.4 樣品測定

應(yīng)用本方法對市面藥店里隨機購買的含有克霉唑的藥品進行分析，所得結(jié)果列于表2。檢測結(jié)果和各種劑型的標示量相比相差不大，代表性樣品里克霉唑的全掃描總離子圖和定性全掃描質(zhì)譜圖見圖3。

表2 藥品中克霉唑含量

圖3 含克霉唑的代表性樣品全掃描色譜圖(A)和定性全掃描質(zhì)譜圖(B)Fig.3 Full SCAN chromatogram(A) and SCAN mass spectrogram(B) of representative samples containing clotrimazole

3 結(jié)論

本文建立了同位素稀釋，氣相色譜-質(zhì)譜法測定藥品中克霉唑含量的方法。本方法針對不同藥品的劑型和所含輔料不同，優(yōu)化了前處理條件，方法前處理簡單、精密度及準確性好和靈敏度高，可為含克霉唑藥品的安全監(jiān)測提供技術(shù)支持。