李滿秀, 宋志英, 任光明, 趙三虎, 李海平

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州 034000)

碳量子點(CQDs)由尺寸在10 nm以下分散的類球狀碳顆粒組成，具有良好的生物相容性、耐光漂白、低毒性及合成原料廉價易得等特點[1 -3 ]。但是無雜元素?fù)诫s、無表面鈍化劑修飾的CQDs表現(xiàn)出選擇性較差、活性位點少和較低的熒光發(fā)射，而摻雜其他元素的CQDs[4 - 7]，其反應(yīng)活性、熒光產(chǎn)率明顯提高，具有更穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)和優(yōu)良的催化性能。

氨芐青霉素(Ampicillin)又稱氨芐西林，是半合成的青霉素，因其價格低廉、使用便捷、且抗菌作用強等優(yōu)點而成為最常用的抗生素之一。而由于其大量使用，給許多動物源性食品帶來了極大的安全隱患,因此對痕量氨芐青霉素定量檢測顯得尤為重要。目前測定氨芐青霉素的方法有受體識別分析法[8]、生物傳感器檢測法[9,10]、高效液相色譜法[11]、高效毛細(xì)管電泳法[12]和熒光法[13 - 15]等。與其他測定方法相比，熒光法具有檢測快速、操作簡單和低成本等優(yōu)勢，因而得到人們更多的青睞。本文以檸檬酸三鈉、11-氨基十一烷酸、NaH2PO4和聚乙二醇為原料，采用微波法制備了一種穩(wěn)定的、高熒光量子產(chǎn)率的氮磷共摻雜碳量子點(NPCQDs)并對其進(jìn)行了表征。研究表明在NPCQDs中加入黃芩苷能使其熒光猝滅，再向體系中加入氨芐青霉素，導(dǎo)致體系的熒光恢復(fù)，基于此構(gòu)建“關(guān)-開”型熒光探針可提供一種檢測氨芐青霉素的新方法。方法操作簡單、靈敏度高、耗時短、成本低，可用于藥品、奶類中氨芐青霉素的測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本，日立公司)；傅里葉紅外光譜儀(日本，島津公司)；Enlution-220型紫外-可見分光光度計(上海萊瑞科學(xué)儀器有限公司)；pHS-3CT型酸度計(上海大普儀器有限公司)；AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；透析袋1 000(美國)。

黃芩苷(都萊公司)標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0×10-3mol·L-1)：準(zhǔn)確稱取44.63 mg黃芩苷，用N-N二甲基甲酰胺溶解，并定容到100 mL容量瓶中備用。氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0×10-3mol·L-1)：準(zhǔn)確稱取20.15 mg氨芐青霉素，用超純水溶解，并定容到50 mL容量瓶中備用。pH=8.6的Tris-HCl緩沖溶液：50 mL 0.1 mol·L-1Tris溶液與12.4 mL 0.1 mol·L-1HCl混合均勻后，加超純水稀釋至100 mL。檸檬酸三鈉、NaH2PO4、硫酸奎寧(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；11-氨基十一烷酸(阿拉丁公司)；聚乙二醇(天津福晨化學(xué)試劑廠)；N-N二甲基甲酰胺(天津永大化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；試劑級別為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CQDs和NPCQDs的制備CQDs的制備：稱取0.5 g檸檬酸三鈉于100 mL燒杯中，加入8.0 mL超純水和10 mL聚乙二醇，在室溫下攪拌均勻后放入微波反應(yīng)儀中,設(shè)置反應(yīng)時間為240 s,功率為455 W進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到粘稠狀淡黃色液體，自然冷卻，過濾，用超純水定容到50 mL 的容量瓶中，得到均一的CQDs溶液。NPCQDs的制備：稱取0.5 g NaH2PO4于100 mL燒杯中，加入8 mL超純水，用玻璃棒攪拌使其溶解，再加入0.5 g檸檬酸三鈉，0.1 g 11-氨基十一烷酸和10 mL聚乙二醇，在室溫下攪拌均勻后放入微波反應(yīng)儀中，設(shè)置反應(yīng)時間為240 s，功率為455 W進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到粘稠狀橘黃色液體，自然冷卻，過濾，用超純水定容到50 mL的容量瓶中，得到均一的NPCQDs溶液。

將制得的CQDs與NPCQDs在預(yù)處理過的透析袋中透析24 h，同時在冷凍干燥機中冷凍干燥，得到CQDs與NPCQDs的固體。

1.2.2 熒光測定取0.14 mL 3.4×10-2mol·L-1的NPCQDs于10 mL的比色管中，再依次加入1 mL pH=8.6的Tris-HCl緩沖溶液和不同濃度梯度的黃芩苷溶液，用超純水定容，振蕩并搖勻，在激發(fā)/發(fā)射波長為355/440 nm 條件下測定其熒光強度。取0.14 mL 3.4×10-2mol·L-1的NPCQDs于10 mL的比色管中，再依次加入1 mL pH=8.6的Tris-HCl緩沖溶液，1 mL 1.0×10-3mol·L-1的黃芩苷溶液，不同濃度梯度的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容，振蕩并搖勻，在激發(fā)/發(fā)射波長為355/440 nm條件下測定其熒光強度(測定中激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。

1.2.3 樣品處理頭孢氨芐膠囊：取0.022 g藥品用超純水溶解，定容于25 mL的比色管中，用于氨芐青霉素的測定。牛奶：取5 mL的牛奶樣品，加入3 mL 19%的三氯乙酸(TCA)在超聲振蕩儀中振蕩60 s，選擇4 000 r·min-1離心15 min，過濾之后取3 mL的上清液，于上清液中加入2 mL正己烷進(jìn)行脫脂，混勻，并靜置1 min處理后，再次選擇4 000 r·min-1離心15 min，棄去正己烷層，最終得到待測樣品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制黃芩苷-NPCQDs的熒光猝滅標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制0.1～1.3(×10-4)mol·L-1的黃芩苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照實驗方法“1.2.2”測定其熒光強度，然后以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，體系的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨芐青霉素對體系熒光恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制0.1～7.0(×10-5)mol·L-1的氨芐青霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照實驗方法“1.2.2”測定其熒光強度，然后以氨芐青霉素濃度為橫坐標(biāo)，體系的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮磷共摻雜碳量子點合成條件的優(yōu)化

為了得到性能優(yōu)良的NPCQDs，在不同微波時間(120 s、180 s、210 s、240 s、270 s)和不同微波功率(260 W、325 W、390 W、455 W、520 W、585 W)下制備NPCQDs(圖1和圖2)。結(jié)果表明，當(dāng)微波時間為240 s，微波功率為455 W時，得到的NPCQDs的熒光強度較大且穩(wěn)定。

2.2 光譜特征

2.2.1 紅外光譜紅外光譜如圖3所示：1 107 cm-1處為C-O-C不對稱和對稱伸縮振動；1 325 cm-1處為P=O伸縮振動峰；1 476 cm-1處為C=N伸縮振動吸收峰；位于1 661 cm-1處的峰為C=O的伸縮振動吸收峰；2 908 cm-1處為C-H的伸縮振動峰；3 310～3 494 cm-1處的寬峰為-OH、N-H的伸縮振動吸收峰。數(shù)據(jù)可以說明兩種材料表面可能存在較多的羥基與羧基，而NPCQDs在3 310～3 494 cm-1峰比CQDs峰寬，且在1 325 cm-1、1 476 cm-1處NPCQDs比CQDs相比吸收增強，表明成功摻雜了N、P元素[16]。

圖2 功率對制備NPCQDs的影響Fig 2 Influence of power on preparation of NPCQDs

圖3 CQDs和NPCQDs的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of CQDs and NPCQDs1.CQDs;2.NPCQDs.

2.2.2 熒光表征對NPCQDs和CQDs進(jìn)行熒光表征可知，NPCQDs在355 nm激發(fā)下，在440 nm處有最大發(fā)射，CQDs在340 nm激發(fā)下，在438 nm處有最大發(fā)射。從圖4可以看到，NPCQDs的熒光強度明顯高于CQDs，且發(fā)射波長略有紅移，初步認(rèn)為N、P的摻雜可能改變了CQDs表面的化學(xué)環(huán)境，引入更多的表面缺陷，導(dǎo)致發(fā)光性質(zhì)改變；或者是雜原子的孤對sp2雜化態(tài)會在CQDs表面形成共軛集群，從而改善CQDs表面的電子密度和透光性，對其內(nèi)在屬性進(jìn)行調(diào)整[17]。

2.2.3 紫外表征如圖5所示：NPCQDs紫外吸收光譜的吸收峰為315 nm，而CQDs的紫外吸收光譜的吸收峰為323 nm，摻雜N、P的CQDs發(fā)生藍(lán)移。

圖4 CQDs與NPCQDs的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of NPCQDs and CQDs

圖5 CQDs和NPCQDs的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of NPCQDs and CQDs1:NPCQDs;2：CQDs.

2.3 熒光量子產(chǎn)率的測定

本實驗采用硫酸奎寧作參比物質(zhì)，測定NPCQDs的熒光量子產(chǎn)率，當(dāng)激發(fā)波長為360 nm時,NPCQDs的熒光量子產(chǎn)率達(dá)到12%?？梢钥闯?，以檸檬酸三鈉等為原料制備得到的NPCQDs的熒光性能很好。

2.4 分析條件的優(yōu)化

圖6 pH值對體系熒光強度的影響Fig.6 Effect of pH value on fluorescence intensity of the system1.NPCQDs+Skullcap glycosides;2.NPCQDs+Skullcap glycosides+Ampicillin.

2.4.1 體系緩沖溶液的選擇分別考察了三酸緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液對體系熒光強度的影響。其中Tris-HCl緩沖溶液對NPCQDs的作用最佳，所以本實驗選擇Tris-HCl作為緩沖溶液。進(jìn)一步考察了不同pH值Tris-HCl緩沖溶液對體系熒光強度的影響，配制不同pH的Tris-HCl緩沖溶液，按實驗方法加入不同的pH緩沖溶液，測定其熒光強度，探究了黃芩苷對NPCDQs的熒光猝滅率(F′0-F′)/F′0的影響，以及氨芐青霉素對NPCDQs熒光恢復(fù)率(F-F0)/F0的影響(圖6)。綜合考慮，本實驗選擇在pH=8.6的Tris-HCl緩沖溶液中測定熒光強度。

2.4.2 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響考察了反應(yīng)時間分別為10、20、30、40、50、60、90、120 min時黃芩苷對NPCQDs熒光猝滅率，以及氨芐青霉素對NPCQDs的熒光恢復(fù)率的影響。根據(jù)圖7可知，當(dāng)放置時間為10 min時猝滅、恢復(fù)率較好，故實驗選擇在10 min進(jìn)行測量。

2.4.3 溫度對體系熒光強度的影響考察了反應(yīng)溫度分別為15、25、35、45、55 ℃時黃芩苷對NPCQDs的熒光猝滅率，以及氨芐青霉素對NPCQDs的熒光恢復(fù)率的影響。由圖8可知：溫度越低，熒光猝滅率越好，溫度在15 ℃時，熒光恢復(fù)最好，另外，NPCQDs的熒光強度隨著溫度的升高在不斷減弱。綜合來看，溫度在15 ℃時實驗效果最好，所以實驗選擇在室溫下進(jìn)行測量。

圖7 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響Fig.7 Effect of time on fluorescence intensity of the system1.NPCQDs+Skullcap glycosides+Ampicillin;2.NPCQDs+Skullcap glycosides.

圖8 溫度對體系熒光強度的影響Fig.8 Effect of temperature on fluorescence intensity of the system1.NPCQDs+ Skullcap glycosides+Ampicillin;2.NPCQDs+Skullcap glycosides.

2.5 黃芩苷對氮磷摻雜碳量子點的熒光猝滅作用

研究表明，NPCQDs與黃芩苷作用后，其發(fā)射波長440 nm處的熒光強度明顯減弱，且隨黃芩苷濃度的增加不斷減弱(圖9)。NPCQDs熒光強度減弱程度與黃芩苷的濃度在0.1～1.3(×10-4) mol·L-1呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：F=-295.97c+695.29(10-4mol·L-1)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9900。熒光猝滅原因可能是黃芩苷表面富含的羥基取代基與NPCQDs表面的羧基反應(yīng)結(jié)合形成無熒光的復(fù)合物[18]從而減弱了NPCQDs的熒光發(fā)射?？紤]黃芩苷濃度會影響到NPCQDs熒光恢復(fù)程度和線性范圍，選擇濃度為1.0×10-4mol·L-1的黃芩苷溶液作為NPCQDs猝滅劑對氨芐青霉素進(jìn)行檢測。

2.6 “關(guān)-開”型熒光探針的構(gòu)建及對氨芐青霉素的測定

在優(yōu)化的條件下，考察了猝滅后的NPCQDs熒光恢復(fù)程度與氨芐青霉素濃度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)氨芐青霉素濃度在1～70 μmol·L-1內(nèi)與黃芩苷-NPCQDs熒光恢復(fù)呈線性關(guān)系。在室溫下，掃描NPCQDs在激發(fā)波長355 nm下的熒光光譜圖，其最大發(fā)射波長位于440 nm。在該波長下黃芩苷、氨芐青霉素以及二者反應(yīng)的產(chǎn)物均無明顯熒光，故對實驗結(jié)果不會造成影響。由圖9可知，黃芩苷的加入可以猝滅NPCQDs的熒光，熒光信號“關(guān)閉”;加入氨芐青霉素后，其表面所含氨基與黃芩苷表面的羥基之間形成分子間氫鍵，使得NPCQDs得到釋放，從而使熒光得到恢復(fù)(圖10)，體系的熒光信號處于“打開”狀態(tài)，通過熒光探針的“關(guān)-開”模式實現(xiàn)了對氨芐青霉素進(jìn)行選擇性識別。

2.7 猝滅體系對氨芐青霉素的選擇性

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了常見的糖類，無機鹽，氨基酸等可能的共存物質(zhì)對恢復(fù)體系的影響，結(jié)果表明：在相對誤差為±5%的范圍內(nèi)，各種共存物質(zhì)的允許量如表1所示。糖類對體系的影響較小，F(xiàn)e3+、色氨酸對體系干擾較大，但不影響實際樣品的測定。

圖9 黃芩苷對NPCQDs的熒光猝滅Fig.9 Fluorescence quenching of NPCQDs by Skullcap glycosides1→12 (cskullcap glycosides)：0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3(×10-4)mol·L-1.

圖10 氨芐青霉素對猝滅體系的響應(yīng)Fig.10 Response of ampicillin to quenching system1→12 (campicillin)：0.1，0.2，0.3，0.6，0.9，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0(×10-5)mol·L-1.

表1 干擾物質(zhì)的影響

2.8 工作曲線，檢出限和精密度

在優(yōu)化的實驗條件下，黃芩苷-NPCQDs體系的熒光強度與氨芐青霉素的濃度在1～70 μmol·L-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：F=35.451c+421.67(10-5mol·L-1)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9926。對3.5×10-5mol·L-1氨芐青霉素的10次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.17%，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算本法的檢出限為7.9×10-7mol·L-1。

2.9 樣品分析

分別取經(jīng)處理并稀釋過的樣品溶液按實驗方法測定了氨芐膠囊和牛奶中氨芐青霉素的含量，每個樣品平行測定5次。為了進(jìn)一步驗證該方法的準(zhǔn)確性，測定了樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 頭孢氨芐膠囊和牛奶樣品測定及回收率(n=5)

3 結(jié)論

本研究制備了一種高穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率的水溶性NPCQDs，利用黃芩苷與NPCQDs結(jié)合引起熒光猝滅的現(xiàn)象，建立了“關(guān)-開”型熒光探針測定氨芐青霉素的新方法。該“關(guān)-開”型NPCQDs熒光探針具有操作簡單，靈敏度高，選擇性好等優(yōu)點，適用于藥品及牛奶中氨芐青霉素的檢測，拓展了碳量子點在分析測試方面的應(yīng)用。