陳樹兵，余曉玲，李 雙，方科益，余曉琴，韓 超，王傳現(xiàn)

(1.寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江寧波 315040；2.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都，610097；3.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015；4.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135)

我國作為豬肉消費大國，其肉制品的生產(chǎn)安全直接關(guān)系到民生建設(shè)。近些年，出現(xiàn)的“注水肉”問題與非法使用新型蓄水類藥物直接相關(guān)。新型蓄水類藥物主要包括：阻斷M膽堿受體的抗膽堿藥物(阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿)，局部麻醉藥物(普魯卡因、利多卡因)，抗組胺類藥物(異丙嗪)和腎上腺素受體激動藥物(腎上腺素及其代謝物4-羥基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羥基扁桃酸)[1 - 10]。這些藥物的非法使用將不可避免地殘留于豬肉食品中,進(jìn)而對人體中樞神經(jīng)造成不良影響。目前，我國蓄水類藥物殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)缺乏，已有文獻(xiàn)多是按照某一類藥物建立的，適應(yīng)范圍單一[1,2,8,11,12]，尚無同時測定豬肉中9種蓄水類藥物及其代謝物的報道。因此，建立豬肉中蓄水類藥物的高通量篩查方法，對于提高監(jiān)管工作效率、保障豬肉食品安全具有重要的意義。

蓄水類藥物檢測主要涉及前處理技術(shù)和儀器分析兩方面。已有方法主要采用固相萃取柱凈化。例如：王海燕等[1]對畜肉中阿托品類藥物殘留量測定，前處理采用MCX小柱凈化；胡海山等[8]對動物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量測定，乙腈提取后經(jīng)Oasis HLB小柱凈化；另外，段科等[5]對肉中的阿托品類藥物殘留量測定，乙腈提取后正己烷除油凈化。采用固相萃取柱凈化，步驟復(fù)雜且實驗成本較高，而乙腈作為提取液，沒有兼容到強(qiáng)極性物質(zhì)的提取，對偏極性的蓄水類藥物不能保證回收率。如何把極性物質(zhì)從水溶液中有效提取出來，這始終是一個艱巨挑戰(zhàn)。隨著質(zhì)譜的發(fā)展和推廣，一次進(jìn)樣完成多類藥物殘留分析已成為可能。藥物殘留正逐漸由液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)目標(biāo)型檢測向高分辨質(zhì)譜(HRMS)非目標(biāo)型全掃描檢測轉(zhuǎn)變。與傳統(tǒng)的LC-MS/MS法相比較，高分辨質(zhì)譜儀可直接采集高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)(m/z200,分辨率70 000)，大大降低了近似質(zhì)量數(shù)的干擾，通過自動觸發(fā)二級，避免了假陽性結(jié)果的發(fā)生，特別適合高通量的篩查檢測。本文利用載體輔助液-液萃取技術(shù)，通過一次前處理實現(xiàn)了9種常見注水類藥物的提取凈化，同時結(jié)合四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測，為提高監(jiān)管工作效率，保證動物源性食品安全提供了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司)，配有H-ESI Ⅱ源。UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)，配有自動進(jìn)樣器。硅藻土柱型號為Chromabond XTR(1 000 mg)。

9種蓄水類藥物標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma和Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥95%。二甲基亞砜(分析純)購自南京化學(xué)試劑一廠。提取液的配制：稱取4.3 g的H2C2O4，用500 mL水溶解，氨水調(diào)節(jié)pH至3.0。色譜純甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為色譜純，購自德國Merck公司。實驗用水為Milli-Q超純水(18.2 ΩM·cm)。

1.2 提取凈化流程

基質(zhì)樣品來自國家豬肉殘留監(jiān)控抽樣和進(jìn)出口送檢企業(yè)。稱取5.00 g樣品，加入10 mL提取液，振蕩、各超聲5 min，4 500 r/min下離心5 min；取水相上大孔硅藻土柱后，平衡5 min，用10 mL乙腈洗脫2次，下接50 mL離心管，并加入0.5 mL二甲基亞砜，乙腈定容至20 mL；取出10 mL，氮吹后用純水定容至1.0 mL，過0.22 μm 濾膜，待分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫：0～3 min，B相保持5%；3～6 min，B相5%～90%；6～8 min，B相保持90%；8～8.1 min，B相90%～5%。流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜在正/負(fù)離子轉(zhuǎn)換模式下進(jìn)行全掃描，質(zhì)量范圍：m/z100～500，分辨率70 000，自動增益控制(AGC)目標(biāo)值5.0×105；4-羥基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羥基扁桃酸采用負(fù)離子模式2 700 V，其余成分則采用正離子模式3 800 V；離子傳輸管溫度為300 ℃；鞘氣流速(N2)35 L/h；輔助流速(N2)10 L/h；氣化室溫度350 ℃。在樣品運行前對儀器分別進(jìn)行正、負(fù)離子校正；二級采用自動觸發(fā)模式，分辨率35 000，AGC目標(biāo)值2.0×105，碰撞能量范圍25%～40%，保留時間采集范圍：根據(jù)一級色譜圖中各個目標(biāo)物的保留時間值±1.0 min。

1.4 定性、定量分析

定性分析時精確質(zhì)量誤差低于5.0×10-6，同時比對保留時間、同位素分布、主要二級碎片和二級質(zhì)譜圖相似度，綜合判斷，避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

空白樣品按照“1.2”處理，在得到的基質(zhì)溶液中加入上述9種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制基質(zhì)加標(biāo)溶液并進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，儀器響應(yīng)值(響應(yīng)值=標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為樣品中待測物濃度定量的依據(jù)。其中，高濃度加標(biāo)樣品應(yīng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

考慮到豬肉基質(zhì)的高脂肪屬性，且9種待測物均為堿性化合物,水溶性強(qiáng),方法采用酸化的水溶液進(jìn)行提取，在保證9種蓄水類化合物高提取率的同時，又可以防止脂肪被過多的提取出來，降低脂肪的干擾。H2C2O4含有的兩個羧基基團(tuán)，較其他可揮發(fā)性甲酸、乙酸，具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和酸性，此外H2C2O4作為金屬螯合劑，可大大降低金屬離子的干擾。

2.2 提取劑的添加量對柱填料的影響

提取液的添加量要充分考慮柱子填料的含量，本文選擇硅藻土柱Chromabond XTR(1 000 mg)。實驗中分別比較了上樣量為5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL時柱子的負(fù)載情況，在上樣量達(dá)到12 mL和15 mL時，柱子已達(dá)到飽和并滲出，水溶液的滲出會導(dǎo)致氮吹濃縮過程大大延長。另外，當(dāng)上樣量為5 mL和8 mL時，柱子的填料未充分浸入水溶液，大大降低了柱子的利用率，同時對于9種待測藥物本就很低的檢出限量來說，也增加了儀器檢出的難度。因此，本研究最終將上樣體積確定為10 mL。

圖1 乙腈洗脫體積對9種注水類藥物回收率的影響Fig.1 Effect of elution volume of acetonitrile on recovery of 9 waterflooding drugs

2.3 洗脫體積的優(yōu)化

水相提取液上樣后，以純乙腈作為洗脫液，通過乙腈的逐級滲入，注水類藥物按照極性強(qiáng)度依次從飽和的硅藻土柱上洗脫下來。實驗中分別考察乙腈作為洗脫溶劑的添加量為10 mL、10 mL×2和10 mL×3對待測物回收率的影響。由圖1可見，當(dāng)乙腈的體積為10 mL×2和10 mL×3時，提取率趨于穩(wěn)定，9種待測注水類藥物在豬肉中的回收率均保持在80%以上。從節(jié)約氮吹濃縮的時間和成本的角度出發(fā)，確定純乙腈作為洗脫液的洗脫體積為10 mL×2。

2.4 儀器條件優(yōu)化

通過注射泵連續(xù)進(jìn)樣，對上述蓄水類藥物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，獲得每種化合物的最佳電離方式和分子離子峰的存在形式。其中4-羥基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羥基扁桃酸采用ESI-模式,其余化合物均采用ESI+模式。

流動相中加入0.1%甲酸能增加正離子模式檢測下物質(zhì)的電離效率,促進(jìn)[M+H]+離子生成，同時進(jìn)一步考察NH4Ac添加量對待測化合物的影響，NH4Ac從2 mmol/L到10 mmol/L，結(jié)果表明9種蓄水類藥物在0.1%甲酸溶液中均獲得了最佳的色譜峰形、分離效果和質(zhì)譜信號響應(yīng)。從減小儀器污染的角度出發(fā)，本文最終采用含有0.1%甲酸水溶液作為流動相A，全程采用梯度洗脫，實現(xiàn)了9種待測物的有效分離。9種注水類藥物的提取離子色譜圖見圖2。

圖2 9種蓄水藥物的提取離子色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of 9 waterflooding drugs

2.5 加標(biāo)回收結(jié)果分析

結(jié)果表明，腎上腺素及其代謝物4-羥基-3-甲氧基-扁桃酸在5.0～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，其他藥物(異丙嗪，阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、普魯卡因和利多卡因)在0.5～5.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，各自呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.990，滿足定量要求。9種待測物的回收率在80.0%～95.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。用基質(zhì)提取液添加低水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液(腎上腺素及代謝物為5.0 μg/kg，其他待測物為0.5 μg/kg)，獲得每種待測物對應(yīng)信噪比(S/N)≥10時的含量，以此為該化合物的定量限(LOQ)(表1)。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，操作簡便,適用于豬肉中蓄水類藥物殘留的快速篩查。

表1 豬肉中9種注水類藥物的定量限(LOQs)、線性方程及不同添加濃度的平均回收率(n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了豬肉中常見的9種蓄水類藥物：腎上腺素及其代謝物4-羥基-3-甲氧基-扁桃酸和3，4-二羥基扁桃酸、異丙嗪、阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、普魯卡因和利多卡因的快速篩查方法。待測物經(jīng)水溶液提取后,利用硅藻土柱完成水溶性藥物的同時提取、凈化、濃縮過程。同時結(jié)合四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，實現(xiàn)了上述藥物殘留的“一步式”多殘留篩查。該方法操作簡單,重現(xiàn)性好,定量限低,完全滿足國標(biāo)中規(guī)定的豬肉中9種蓄水類藥物的測定需求。