丁簫月，馮建軍，辛甜甜，郭松林，王藝?yán)?，?鵬

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，福建廈門 361021)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可引發(fā)人類和哺乳動物敗血癥等疾病[1,2]，日本鰻鱺敗血腹水病、體表潰瘍病和腸炎病均與嗜水氣單胞菌感染有關(guān)[3,4]，因此，建立嗜水氣單胞菌檢測技術(shù)可有效預(yù)防和控制病害發(fā)生，減小病害造成的損失。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]和熒光免疫抗體法[6]檢測嗜水氣單胞菌已有報道，但ELISA法如果沒有生物素-鏈霉親和素的信號放大作用，其檢測限只有4.0×105CFU/mL，而熒光抗體法只是采用熒光顯微鏡半定量觀察，靈敏度更低。時間分辨熒光免疫檢測(Time -Resolved Fluorimmunoassay,TRFIA)以稀土螯合物作為標(biāo)記物，而稀土螯合物的熒光壽命較長，免疫反應(yīng)后，延緩測量時間，待短壽命的背景熒光完全衰變后再測量螯合物的熒光[7，8]，靈敏度比ELISA法和熒光抗體法高約兩個數(shù)量級。我們曾應(yīng)用解離增強(qiáng)TRFIA法檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌[9]，但該方法是用本身沒有熒光的標(biāo)記物標(biāo)記抗體。標(biāo)記物本身即是熒光團(tuán)，反應(yīng)后不需要解離顯色的稀土螯合物探針已見諸于報道[10,11]，但另一種熒光標(biāo)記物更具有優(yōu)勢，即熒光納米粒子[12,13]。用于TRFIA的標(biāo)記粒子是納米級的聚苯乙烯微粒共價包埋多個稀土螯合物分子[14]，由于納米粒子表面修飾有羧基、氨基等功能性基團(tuán)，可以用來偶聯(lián)蛋白抗體進(jìn)行標(biāo)記。用稀土螯合物納米粒子作為標(biāo)記物已在TRFIA檢測中得到應(yīng)用[15,16]，主要用于可溶性小分子物質(zhì)，但用于顆粒性的病原菌檢測尚未見報道。

在本文中，我們將銪螯合物納米粒子標(biāo)記在嗜水氣單胞菌抗體上，采用雙抗夾心TRFIA法，建立了一種檢測嗜水氣單胞菌的新方法。結(jié)果證明納米粒子標(biāo)記的TRFIA法同樣可用于顆粒性病原菌檢測。該方法線性范圍寬，檢測限為1.0×103CFU/mL，遠(yuǎn)高于ELISA法及熒光抗體法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Perkins-Elmer Victor X4多標(biāo)記分析儀(美國，Perkins-Elmer公司)；GE Healthcare SPA親和層析柱(美國，GE Healthcare公司)。

羧基修飾的銪螯合物熒光納米粒子(Fluoro-Max)購自美國Thermo fisher scientific公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(Sulfo-NHS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)購自美國Pierce公司，其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。菌株B15獲得于病變的日本鰻鱺，并經(jīng)Biolog自動生化鑒定系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌；實驗用鰻鱺購自福建莆田養(yǎng)殖場；兔抗嗜水氣單胞菌抗體(IgG)據(jù)文獻(xiàn)方法[17]制得，其效價為1∶25 600。

1.2 實驗方法

1.2.1 IgG的納米粒子標(biāo)記參照納米粒子標(biāo)記說明書以及文獻(xiàn)報道[18]，向離心管中加入20 μL納米粒子和180 μL MES緩沖液(pH=6.0，0.05 mol/L)，混合均勻后加入4 μL EDC溶液(0.1 mol/L)，迅速加入10 μL Sulfo-NHS溶液(0.05 mol/L)，室溫反應(yīng)15 min，加入0.28 μL巰基乙醇，室溫反應(yīng)10 min。4 ℃ 離心35 min(15 000 r/min)，去除上清液，加入200 μL 磷酸鹽緩沖液(pH=7.5，0.1 mol/L)溶解的IgG抗體，反應(yīng)2 h后離心去除上清液。加入20%BSA封閉液200 μL，離心去上清后，用200 μL含有SDS的去離子水洗滌標(biāo)記納米粒子三次，最后復(fù)溶于200 μL 0.05 mol/L MES緩沖液，得納米粒子-IgG溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?biāo)記效果亦根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]驗證，效果良好。

1.2.2 菌株B15的納米粒子TRFIA法檢測用0.05 mol/L，pH=9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋IgG，每孔加入100 μL稀釋后的IgG到96孔微孔板中，包被12 h，包被溫度37 ℃，用0.05 mol/L Tris-HCl洗滌液(pH=7.8)洗滌3次，加入3%BSA 200 μL封閉2 h，封閉溫度37 ℃，洗滌液洗滌3次，加入分析緩沖液稀釋的不同濃度嗜水氣單胞菌B15菌懸液100 μL，振動孵育1 h，孵育溫度37 ℃，洗滌液洗滌3次后，加入工作濃度的納米粒子-IgG溶液，振動孵育后再用洗滌液沖洗6次，多標(biāo)記分析儀上測量時間分辨熒光(TRF)，測量參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長615 nm，延遲時間0.4 ms，測量時間0.4 ms。樣品孔的TRF值設(shè)為P，對照孔的TRF值設(shè)為N，P/N>2時判斷為陽性，其中對照孔以分析緩沖溶液代替B15菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

以P/N值為指標(biāo)，抗體包被時間(A)、抗體包被濃度(B)、納米粒子-IgG的免疫反應(yīng)時間(C)、納米粒子-IgG稀釋度(D)為4個因素，選擇3個水平進(jìn)行L9(34)正交試驗，因素水平列于表1。

表1 正交試驗設(shè)計

正交試驗結(jié)果如表2所示，K1、K2和K3表示每個因素在三個水平下對應(yīng)P/N值的和，k1、k2和k3則代表

表2 試驗方案和結(jié)果

(續(xù)表2)

三個水平所對應(yīng)P/N值的平均值，R為極差，即該因素k值的極大值與極小值之差，k值越大，表示該水平的P/N值越大，水平越優(yōu)，R值越大，表示該因素對P/N值的影響越大。因此，根據(jù)表2極差分析結(jié)果可知，因素A影響結(jié)果最大，D次之，因素B和C的影響結(jié)果相對較小，四個因素的影響程度依次為抗體包被時間>納米粒子-IgG稀釋度>納米粒子-IgG的免疫時間>抗體包被濃度。由k值可以得出最優(yōu)組合為A2B1C2D2，即12 h抗體包被時間，0.5 μg/mL抗體包被濃度，3 h免疫時間為和1∶4 000 的納米粒子-IgG稀釋度。

圖1 正交試驗的結(jié)果驗證Fig.1 Verification of orthogonal experimental results

2.2 正交試驗結(jié)果驗證

正交試驗得出的最優(yōu)組合為A2B1C2D2，但是該組合并未出現(xiàn)在所做9次的正交試驗設(shè)計中，為了驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在正交試驗設(shè)計的9次組合基礎(chǔ)上，加上該組合，一起重新進(jìn)行基于納米粒子標(biāo)記的TFRIA法檢測菌株B15，結(jié)果示于圖1。第10組的組合為A2B1C2D2，其P/N值最大，正交試驗確實對結(jié)果的優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)意義，并且可以降低篩選成本，提高篩選效率。

2.3 延遲時間的選擇

一般鑭系元素螯合物的熒光衰變時間約為0.9 ms，其它熒光團(tuán)的衰變時間為1～100 μs，生物樣品中背景熒光的衰變時間只有1～10 μs[19]。為此我們考察了延遲時間在0.1～0.6 ms的TRF，發(fā)現(xiàn)延遲時間在0.2～0.4 ms時，TRF值最大且基本不變，因此選擇延遲時間為0.4 ms。延遲時間過短，會導(dǎo)致干擾熒光進(jìn)入檢測器影響測定，延遲時間過長，由于鑭系元素螯合物熒光也會衰變，導(dǎo)致TRF減小。

2.4 重復(fù)性實驗

固定嗜水氣單胞菌濃度，采用正交試驗篩選的最優(yōu)條件，隨機(jī)在同一微孔板上進(jìn)行納米粒子TRFIA測定，計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差(板內(nèi)變異系數(shù)=板內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%)。同理，在6塊微孔板上進(jìn)行納米粒子TRFIA測定，計算板間變異系數(shù)[20]。得出菌株B15檢測的板內(nèi)變異系數(shù)為2.70%，板間變異系數(shù)為9.62%。說明該方法穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。

2.5 特異性實驗

我們采用嗜水氣單胞菌菌株B15的抗體與其它14種病原菌菌株(包含不同血清型的嗜水氣單胞菌菌株)，進(jìn)行基于銪螯合物納米粒子標(biāo)記的TRFIA檢測，并同時進(jìn)行菌株B15的檢測，結(jié)果見表3。嗜水氣單胞菌抗體與菌株B15有較強(qiáng)的陽性反應(yīng)，其P/N為22.95，而與其它致病菌菌株無交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果為陰性，說明抗體特異性良好，其它菌株并不干擾B15的檢測。

2.6 工作曲線及檢測限

利用建立的納米粒子標(biāo)記TRFIA法檢測不同濃度菌株B15，其TRF值隨致病菌濃度的增高而增大。分別以時間分辨熒光的對數(shù)值lgTRF為縱坐標(biāo)、細(xì)菌濃度的對數(shù)值lgCFU為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍1.0×103～1.0×108CFU/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.990，以P/N>2時所對應(yīng)的最小濃度為檢測限，其檢測限為1.0×103CFU/mL，遠(yuǎn)高于ELISA[5]及法熒光抗體法[6]，相較于已經(jīng)報道的解離增強(qiáng)TRFIA法檢測病原菌[9]，由于標(biāo)記物為熒光納米顆粒，靈敏度也提高了5倍。

表3 納米粒子TRFIA測定嗜水氣單胞菌抗體的交叉反應(yīng)

2.7 鰻鱺的實際樣品檢測

以腹腔注射嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺組織樣品作為實驗組，腹腔注射生理鹽水的鰻鱺組織樣品作為對照組，建立了雙抗夾心納米粒子TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌，以實驗組的TRF值與對照組的TRF值比值大于2(即P/N>2)時判斷為陽性。針對25個包括肝、鰓、腎、腸、肌組織在內(nèi)的樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖2，樣品均呈陽性，檢出率達(dá)100%，高于ELISA法(圖3，84%)。

圖2 鰻鱺樣品納米粒子TRFIA法檢測結(jié)果(1～5分別代表五條感染后的鰻鱺)Fig.2 The results of detection of A.japonica samples using nanoparticle-TRFIA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

圖3 鰻鱺ELISA法樣品檢測結(jié)果(1～5分別代表五條感染后的鰻鱺)Fig.3 The results of detection of A.japonica samples using ELISA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

3 結(jié)論

建立了基于銪螯合物納米粒子標(biāo)記的TRFIA新方法檢測嗜水氣單胞菌，方法的檢出限提高到1.0×103CFU/mL，高于ELISA法和熒光抗體法，相較于解離增強(qiáng)TRFIA法，靈敏度也得到了進(jìn)一步提高。檢測了25份人工感染的日本鰻鱺樣品，包括鰓、腎、腸、肝和肌肉組織，結(jié)果滿意。納米粒子標(biāo)記TRTIA法檢測病原菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。