劉宇楠, 金香子, 高漢勇, 趙錦花, 何 苗, 李東浩

(延邊大學(xué)化學(xué)系,長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室,吉林延吉 133000)

植物源性食品主要指水果蔬菜類、谷類、豆類等以植物種子、果實或組織部分為原料，直接或加工后所得的食品，是為人類提供能量或營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源[1]?，F(xiàn)階段，為了降低病蟲害對果蔬產(chǎn)率的影響，大量農(nóng)藥被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中[2]，引發(fā)一系列食品安全問題。因此，合理監(jiān)控植物源性食品中農(nóng)藥殘留是改善食品安全狀況，有效緩解食品安全問題的重要途徑和手段[3]。由于植物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，其含有的有機(jī)酸、糖分、色素及水分在殘留農(nóng)藥檢測過程中產(chǎn)生明顯的基質(zhì)干擾[4]，因此需要有效的前處理方法實現(xiàn)對不同類型基質(zhì)的萃取凈化。目前，用于食品中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法有液-液萃取[5]、固相萃取[6]、超聲波輔助萃取[7]、加速溶劑萃取[8]和凝膠滲透色譜[9]等。這些前處理方法使用廣泛，但普遍存在消耗溶劑量大、耗時耗力、前處理周期長等問題。新發(fā)展起來的QuEChERs前處理技術(shù)可用于農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的快速檢測[10 - 12]，雖然消耗的溶劑量相對較少，但仍然需要較為繁瑣的處理步驟。鑒于食品安全檢測的時效性，迫切需要一種簡便、快速、高效的前處理方法與氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)等儀器分析技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)植物源性食品中殘留農(nóng)藥的快速檢測。

氣-液微萃取(Gas-liquid Microextraction,GLME)是基于氣流吹掃微注射萃取(Gas Purge Micro Syringe Extraction)技術(shù)發(fā)展而成的，一種集萃取、凈化、濃縮為一步的前處理方法。該技術(shù)通過加熱樣品基質(zhì)，使目標(biāo)物根據(jù)自身沸點從基質(zhì)中揮發(fā)，在惰性氣體氮氣的帶動下富集在微量的有機(jī)溶劑中，通過目標(biāo)物在有機(jī)溶劑中的溶解度差異，得到進(jìn)一步凈化。此方法的優(yōu)勢在于可以根據(jù)目標(biāo)物與共萃取物間的沸點差異，以及其極性的差異實現(xiàn)多種復(fù)雜基質(zhì)的高效萃取與凈化[13]，在短時間內(nèi)完成色素、脂肪等干擾物質(zhì)的萃取凈化過程。該方法原理與色譜相似，匹配于所有揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分的分析，是一種適用于植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測的快速前處理方法。王釗等[14]利用GLME技術(shù)建立了果蔬中殘留農(nóng)藥的一步萃取方法，并成功檢測出黃瓜等樣品中30種殘留農(nóng)藥。郭子鈺等[15]利用GLME技術(shù)對谷類中27種殘留農(nóng)藥進(jìn)行簡單分析，且其結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。本文以GLME為前處理方法，分別選擇水分含量高的黃瓜，脂肪含量高的谷類樣品玉米，含有果酸、水分和果糖的梨果類樣品蘋果，以及含有大量硫化物的蔥蒜類樣品大蒜為基質(zhì)，通過優(yōu)化方法參數(shù)，建立一種適用于多種植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測的快速前處理方法。該方法可在20 min內(nèi)實現(xiàn)不同食品基質(zhì)中28種殘留農(nóng)藥的有效萃取凈化，為農(nóng)藥殘留的快速分析檢測提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本，島津公司)；XPE105型號分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；FA25勻漿機(jī)(德國，弗魯克公司)；AS系列超聲萃取儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；氣-液微萃取(GLME)儀，由實驗室自組研發(fā)。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純，加拿大Fisher公司)；四氯間二甲苯、氘代戊唑醇、磷酸三苯酯(內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，美國Accustandard公司)；無水Na2SO4(≥99%，中國成都化工有限公司)，用前于馬弗爐中400 ℃灼燒12 h，貯于真空箱中，冷卻后備用。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確移取一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，配制成0.2、0.4、1.0和10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確吸取10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用正己烷逐級稀釋，配制成濃度分別為10、20、50、100、200、500、和1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，同時加入替代內(nèi)標(biāo)儲備溶液和儀器內(nèi)標(biāo)儲備溶液，使內(nèi)標(biāo)濃度均為200 μg/L。

1.2.2 替代內(nèi)標(biāo)溶液準(zhǔn)確稱取四氯間二甲苯和氘代戊唑醇各0.2 g于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成2 mg/L混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 儀器內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確移取儀器內(nèi)標(biāo)磷酸三苯酯母液于20 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，配制成1 mg/L儲備溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 采樣和試樣制備按國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2016)附錄A采集樣品，將樣品粉碎后勻漿使其均一化。將制備好的試樣裝入棕色瓶中，密封標(biāo)記并于-20 ℃冷凍保存。

1.3.2 提取稱取無水Na2SO4、試樣各3 g(精確至0.001 g)，依次加入到15 mL離心管中，加入替代內(nèi)標(biāo)溶液(加標(biāo)實驗中還需加入目標(biāo)物)，加入乙酸乙酯∶二氯甲烷(1∶1,V/V)，超聲萃取15 min后，加入NaCl振蕩，取100 μL上清液加入到樣品管的玻璃棉上，放入GLME樣品槽內(nèi)，取50 μL二氯甲烷加入到250 μL內(nèi)插管中作為接收相，萃取結(jié)束后用二氯甲烷∶丙酮∶乙酸乙酯(1∶1∶1，V/V/V)混合溶劑進(jìn)行洗脫，完成萃取過程。

GLME萃取條件如下：溫度：300 ℃，氣流流速：2 mL/min，冷凝溫度：-4 ℃，萃取時間：5 min。萃取結(jié)束后，洗脫，定容至80 μL，加入20 μL磷酸三苯酯溶液，混勻后，采用GC-MS法進(jìn)行分析。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 氣相色譜條件安捷倫DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。色譜柱溫度程序：40 ℃保持1 min，然后以30 ℃/min程序升溫至130 ℃，再以5 ℃/min升溫至250 ℃，再以10 ℃/min升溫至300 ℃保持1 min。載氣：氦氣(純度≥99.999%)，流速1.34 mL/min；進(jìn)口溫度：290 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件電離模式：電子轟擊(EI)；轟擊能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；GC-MS接口溫度：280 ℃；選擇離子監(jiān)測：每種化合物分別選擇一個定量離子，2～3個定性離子。每組所有需要檢測的離子按照出峰順序，分時段分別檢測。每種化合物的保留時間、定量離子、定性離子及定量離子與定性離子的豐度比值，參見表1。

表1 化合物的保留時間、定量離子、定性離子及定量離子與定性離子的豐度比值

2 結(jié)果與討論

圖1 氣-液微萃取裝置圖Fig.1 Photo of gas-liquid microextraction device

2.1 前處理條件優(yōu)化

GLME裝置如圖1所示。選擇9種代表性農(nóng)藥作為目標(biāo)物進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，分別對萃取溶劑、GLME的加熱溫度和萃取時間進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 萃取溶劑優(yōu)化選擇含水量高的黃瓜樣品進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實驗優(yōu)化超聲萃取溶劑，分別以乙腈、二氯甲烷∶乙腈(1∶1,V/V)和二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1,V/V)為溶劑，超聲萃取15 min后進(jìn)行GLME，進(jìn)樣分析結(jié)果如圖2。二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1,V/V)為超聲萃取溶劑時9種目標(biāo)物回收率在55.4%～89.9%之間，滿足分析要求。選擇二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1,V/)為超聲溶劑。

2.1.2 GLME加熱溫度的優(yōu)化利用GLME技術(shù)，在不同加熱溫度下對9種農(nóng)藥進(jìn)行萃取效果評價，結(jié)果如圖3所示。分別選擇280、300、320 ℃對二嗪磷、六六六、腐霉利、醚菊酯等9個目標(biāo)物進(jìn)行加標(biāo)實驗。

圖2 不同超聲溶劑對農(nóng)藥殘留回收率的影響Fig.2 Effect of different sonicate solvents on pesticide residues recoveries1.β -HCH;2.Diazinon;3.Aldrin;4.Fenthion;5.Procymidone;6.p,p′-DDE;7.p,p′-DDT;8.Tebuconazole;9.Etofenprox.

圖3 GLME加熱溫度對9種目標(biāo)物回收率的影響Fig.3 Effect of heating temperature on recoveries of 9 targets in GLME1.β -HCH;2.Diazinon;3.Aldrin;4.Fenthion;5.Procymidone;6.p,p′-DDE;7.p,p′-DDT;8.Tebuconazole;9.Etofenprox.

圖4 GLME萃取時間對9種目標(biāo)物回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on recoveries of 9 targets in GLME1.β -HCH;2.Diazinon;3.Aldrin;4.Fenthion;5.Procymidone;6.p,p′-DDE;7.p,p′-DDT;8.Tebuconazole;9.Etofenprox.

由圖3可知，當(dāng)加熱溫度為300 ℃時，9種目標(biāo)物都得到了較高的回收率，共同為60.0%～102.9%。選擇300 ℃為加熱溫度。

2.1.3 GLME時間的優(yōu)化萃取時間對GLME效果的影響如圖4所示。分別設(shè)置3、5、7 min對9種目標(biāo)物的萃取時間進(jìn)行優(yōu)化。由圖4可知，萃取時間為5 min時，9種目標(biāo)物回收率均可以滿足分析要求，且結(jié)果良好，回收率在74.0%～112.0%之間，選擇5 min為萃取時間。

2.2 方法線性、檢出限及定量限

由表2可知，28種目標(biāo)農(nóng)藥在0.001～1.000 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9991～1.0000，儀器定量限為0.0010～0.0370 mg/kg。

表2 28種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

(續(xù)表2)

2.3 實際樣品中加標(biāo)回收率

選擇脂肪含量高的玉米樣品進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實驗，其基質(zhì)加標(biāo)總離子流色譜圖如圖5所示。

圖5 玉米樣品基質(zhì)加標(biāo)總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of the spiked maize1.2-Phenylphenol;2.Phorate;3.α -HCH;4.β -HCH;5.Quintozene;6.γ -HCH;7.Terbufos;8.Diazinon;9.Pyrimethanil;10.Vinclozoline;11.Heptachlor;12.Aldrin;13.Fenthion;14.Parathion;15.Triadimefon;16.Pendimethalin;17.Procymidone;18.Trans-chlordane;19.o-p′-DDE;20.Cis-chlordane;21.p,p′-DDE;22.o,p′--DDD;23.o,p′--DDT;24.p,p′-DDT;25.Tebuconazole;26.Bifenthrin;27.Pyridaben;28.Etofenprox.

分別以1倍、2倍和5倍定量限3種加標(biāo)濃度，進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實驗，玉米基質(zhì)中28種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表3所示。由結(jié)果可以看出，28種目標(biāo)物都得到較高的回收率，在65.6%～114.1%之間，RSD在3.2%～19.9%之間。

比較了GLME前處理步驟前后萃取液的總離子流色譜圖變化(圖6)。利用NIST14和NIST14s譜庫對色譜峰定性，結(jié)果顯示GLME對油酸、亞油酸、棕櫚酸類高級脂肪酸有良好的凈化效果。

圖6 玉米加標(biāo)樣品在不同前處理方法下總離子流色譜圖Fig.6 Total ion current chromatogram of the spiked maize sample with different pretreatment methods1.Methyl palmitate;2.Palmitic acid;3.Methyl linoleate;4.Methyl Oleate;5.Linoleic acid;6.Oleic acid;7.β -Monolinolein;8.β -Monolinolein;9.Squalene;10.γ -Tocopherol;11.Campesterol;12.β -sitosterol.

2.4 方法比較

選擇蘋果、大蒜兩種基質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實驗，將本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 23200.8-2016)[18]和國際通用的AOAC方法進(jìn)行比較。表4展示了三種方法對比實驗結(jié)果(28種農(nóng)藥加標(biāo)回收率及檢出濃度)，可以看出在該方法下28種目標(biāo)物回收率良好，蘋果、大蒜加標(biāo)回收率分別在77.6%～114.8%和57.7%～113.7%之間，相比于另兩種方法受到基質(zhì)效應(yīng)影響較小。同時在此方法下，蘋果、大蒜中各有4種和2種殘留農(nóng)藥被檢出，多于國標(biāo)法和AOAC法下殘留農(nóng)藥檢出數(shù)量。

表4 不同實驗方法下28種農(nóng)藥加標(biāo)回收率和檢出濃度對比

(續(xù)表4)

3 結(jié)論

本文基于氣-液微萃取技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法對植物源性食品黃瓜、玉米、蘋果及大蒜中28種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。GLME在對所選農(nóng)藥進(jìn)行高效萃取的同時可以很好地去除基質(zhì)中的色素、脂類等干擾物質(zhì)，所得結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性(回收率在65.6%～114.1%)和重現(xiàn)性(RSD<20.0%)。本方法根據(jù)化合物的沸點差異和極性差異，實現(xiàn)了高效凈化，將萃取、凈化、濃縮結(jié)合為一體，進(jìn)一步簡化實驗步驟，有效縮短了樣品前處理時間(20 min)，并極大地減少了樣品基質(zhì)對精密分析儀器的污染。本方法可滿足痕量水平殘留農(nóng)藥的檢測要求，可以作為植物源性食品中殘留農(nóng)藥的快速檢測方法，為我國食品安全檢測體系的完善提供技術(shù)支撐。