董 林， 王耀輝， 葉世光， 周莉莉， 李 萍， 梁愛斌

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092; 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lym-phoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)中最常見的組織學亞型，在亞洲國家的發(fā)病率超過40%[1]。研究表明，58%～75%的DLBCL患者接受利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松(R-CHOP)一線方案化療可獲得完全緩解(complete response， CR)，但仍有50%的患者緩解后復發(fā)或?qū)煵幻舾?。復發(fā)的患者雖可接受挽救性的大劑量化療聯(lián)合自體造血干細胞移植，但患者總體反應(yīng)率和CR率不高[2-3]。對于大多數(shù)復發(fā)性或難治性DLBCL患者，常規(guī)化學免疫治療方案僅能短暫控制疾病。原發(fā)性難治性疾病患者采用二線化療方案治療時極少能獲得CR。隨著嵌合抗原受體T(chimeric antigen receptor T, CAR-T)治療的興起與成熟，CAR-T細胞治療難治復發(fā) DLBCL患者被廣泛應(yīng)用。

CAR-T細胞治療是一種基因改造的自體免疫治療方法。美國FDA已批準針對CD19的CAR-T 細胞(chimeric antigen receptor T cells recognizing CD19， CD19 CAR-T) 免疫治療用于二線或二線以上全身治療后復發(fā)或難治的DLBCL患者。臨床研究顯示，目前CD19 CAR-T細胞治療對于難治復發(fā)DLBCL的緩解為40%～50%[4-5]，與此相對，CD19 CAR-T在治療難治復發(fā)急性B淋巴細胞白血病中的緩解率高達83%[6]。這表明CD19 CAR-T細胞治療對難治復發(fā)DLBCL的療效尚有提高空間，如何提高CART治療DLBCL的療效成為當前的研究熱點。

DLBCL可根據(jù)基因表達譜(gene expression profile, GEP)分為生發(fā)中心 B細胞樣(GCB)和活化 B 細胞樣(ABC)亞型。研究顯示，兩種亞型的5年無進展生存率(progression-free survival， PFS)和總體生存率(overall survival， OS)分別是 76%vs31%、80%vs45%[7]，因此，ABC亞型的DLBCL預(yù)后更差，現(xiàn)已成為難治復發(fā)DLBCL的主要類型。

CD79突變[8]、CBM復合體異常[9]、髓樣分化初級應(yīng)答基因88(MYD88)突變[10]、重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3)功能缺失[11]導致的NF-κB通路的持續(xù)激活是ABC亞型的 DLBCL最具特色的分子病理學改變。針對該通路的異常激活，目前已有多種藥物被應(yīng)用于臨床，如來那度胺、硼替佐米和伊布替尼。其中，伊布替尼是 Bruton 絡(luò)氨酸激酶的抑制劑，在具有MYD88和CD79A 或CD79B 突變的DLBCL 細胞中，可降低多種蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，同時也降低了Src家族激酶中脾酪氨酸激酶(Syk)和Btk的磷酸化，從而抑制腫瘤生長[10]。Winter等[12]發(fā)現(xiàn)，伊布替尼對DLBCL的客觀緩解率為28%，其中GCB型患者的客觀緩解率為18%，非GCB型患者的客觀緩解率為21%。另一項關(guān)于伊布替尼治療難治復發(fā)DLBCL的研究顯示： 伊布替尼對BCR或MYD88基因突變的ABC亞型患者更為有效[13]。因此，伊布替尼對于復發(fā)難治DLBCL具有一定的療效。目前國際上已有伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T治療難治復發(fā)慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的臨床試驗。Gauthier等[14]發(fā)現(xiàn)，伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T對難治性CLL的客觀緩解率為83%，且無嚴重的細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome， CRS)。對伊布替尼無效或不耐受的復發(fā)難治CLL患者可從該聯(lián)合療法中獲益。目前，伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T治療難治復發(fā)DLBCL尚缺乏相關(guān)研究。

本研究回顧性分析評估伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T方案治療難治復發(fā)DLBCL患者的療效和安全性，以期為難治復發(fā)DLBCL的治療提供臨床思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月—2019年1月在同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科采用CD19 CAR-T治療的26例難治復發(fā)DLBCL患者作為研究對象。根據(jù)既往是否接受口服伊布替尼治療，采用隨機數(shù)字表方法將患者分為兩組： 對照組(n=10)和伊布替尼組(n=16)。所有患者均符合本科CD19 CAR-T治療難治復發(fā)B細胞淋巴瘤的臨床試驗標準(注冊號： NCT02537977)。該試驗的入組標準為： (1) 明確診斷復發(fā)難治DLBCL且腫瘤表面存在CD19 表達的患者，診斷標準依據(jù)NCCN非霍奇金淋巴瘤2017.V5標準；(2) 理解并愿意參加本項臨床試驗并簽署知情同意書；(3) 年齡18～75歲；(4) 通過靜脈能夠獲得足夠的外周血，對淋巴細胞采集沒有其他禁忌證；(5) 預(yù)計生存期>3個月；(6) 有可測量和可評估的淋巴瘤病灶作為療效評估；(7) 前期未接受過任何其他細胞修飾治療。排除標準為： (1) 合并其他種類的惡性腫瘤史；(2) 不 受控制的陽性感染。乙型或丙型肝炎陽性且處于活動期，患有精神疾病，包括癡呆、癲癇、重度抑郁等；(3) 嚴重或不受控制的全身性疾病或任何不穩(wěn)定的系統(tǒng)性疾病；(4) 懷孕或哺乳期女性。

1.2 治療方案

對照組所有患者研究用藥開始前3個月內(nèi)未接受過任何臨床試驗藥物；伊布替尼組患者既往接受過口服伊布替尼規(guī)范治療，1次/d，每次560 mg，至少3周，研究用藥開始前3個月內(nèi)未接受過伊布替尼外任何臨床試驗藥物。對照組(n=10)和伊布替尼組(n=16)患者在CD19 CAR-T細胞輸注前均采用FC方案(氟達拉濱25 mg/m2、環(huán)磷酰胺300 mg/m2)預(yù)處理，CD19 CAR-T劑量為3×106/kg。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計患者姓名、性別、年齡、淋巴瘤亞型、CAR-T前化療次數(shù)、血常規(guī)、血生化、細胞因子、體溫、血壓、療效評估、不良反應(yīng)等指標，并隨訪患者生存。淋巴瘤分期采用Ann Arbor系統(tǒng)。根據(jù)IPI評分標準進行淋巴瘤預(yù)后評分。根據(jù)2017年NCCN指南非霍奇金淋巴瘤療效評估標準進行療效評估。根據(jù)NCI-CTCAE4.0版抗腫瘤藥物毒性分級標準進行不良反應(yīng)定義和分級。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0進行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗、Fisher確切概率法比較兩組患者臨床特征差異。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量以四分位數(shù)進行表示，選擇 Wilcoxon 秩和檢驗進行分析。采用Kaplan-Meier分析法進行生存分析，并采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 患者療效評估

本研究的研究對象共26例，其中男性17例，女性9例；患者中位年齡59歲(18～71歲)，GCB 型7例，non-GCB型19例。26例患者接受CD19 CAR-T治療前中位化療次數(shù)9次(4～15次)，14例患者處于化療或自體造血干細胞移植后復發(fā)狀態(tài)，12例原發(fā)難治患者處于疾病穩(wěn)定或進展狀態(tài)。26例患者接受CD19 CAR-T治療后，10例(38.5%)CR，8例(30.8%)PR，4例(15.3%)穩(wěn)定，4例(15.3%)進展，總反應(yīng)率為69.2%。兩組患者的臨床資料見表1。

表1 26例患者基本臨床資料及療效Tab.1 Clinical characteristics and treatment efficacy of 26 patients

續(xù)表

兩組患者的性別、年齡和DLBCL亞型分布均衡，Ann Arbor分期、IPI評分、既往是否骨髓移植比率、CART前化療次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組10例患者中，3例(30%)獲得了CR，1例(10%)PR，3例(30%)穩(wěn)定，3例(30%)進展，總有效率(CR+PR)為40%(4/10)。伊布替尼組16例患者中，7例(43.7%)CR，7例(43.7%)PR，1例(6%)穩(wěn)定，1例(6%)進展，總有效率為87.5%(14/16)。伊布替尼組患者總有效率(87.5%)遠高于對照組(40%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；伊布替尼組患者CR率高于對照組(43.7%vs30.0%)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。兩組PFS(圖1)和OS(圖2)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 兩組患者CD19 CAR-T治療后PFS曲線分析Fig.1 PFS curve of two groups after CD19 CAR-T therapy

圖2 兩組患者CD19 CAR-T治療后OS曲線分析Fig.2 OS curve of two groups after CD19 CAR-T therapy

表2 兩組患者治療情況Tab.2 Basic information of treatment in two groups

2.2 不良反應(yīng)評估

26例可評價的患者中，19例(73%)出現(xiàn)CRS，包括6例2級CRS(對照組2例、伊布替尼組4例)，13例1級CRS(對照組5例、伊布替尼組8例)，多發(fā)生于CAR-T治療后的4～14 d。對照組和伊布替尼組患者CRS發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(70.0%vs81.0%，P>0.05)；伊布替尼組有2例患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，1例表現(xiàn)為頭暈、寫字手抖，另1例患者表現(xiàn)為嗜睡、計算力減退，對照組患者未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)；對照組和伊布替尼組患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(12.5%vs0.0%，P>0.05)；3例患者出現(xiàn)粒細胞減少，其中對照組2例，伊布替尼組1例，兩組差異無統(tǒng)計學意義(20.0%vs6.2%，P>0.05)；伊布替尼組患者出現(xiàn)1例血小板減少，1例皮疹和1例乙肝再激活引起的爆發(fā)性肝炎，對照組患者未出現(xiàn)血小板減少、皮疹、肝炎病毒再激活，對照組和伊布替尼組這3種不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(0.0%vs6.2%，P>0.05)；伊布替尼組1例患者出現(xiàn)肺部感染，對照組1例患者出現(xiàn)尿路感染，兩組差異無統(tǒng)計學意義(10.0%vs6.2%，P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者不良事件嚴重度評估Tab.3 Severity assessment of adverse reaction in two groups

2.3 細胞因子表達水平分析

統(tǒng)計所有患者在輸注CD19 CAR-T細胞前及輸注后血清細胞因子水平，分析患者細胞治療后體內(nèi)細胞因子水平變化。標本采集時間點為輸注CD19 CAR-T細胞當天清晨、輸注后第1、4、7、10、14、21、28天早晨。分析比較輸注后第28天內(nèi)細胞因子最高水平與輸注前的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與輸注CD19 CAR-T細胞前相比，輸注后患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著性升高，(P均為0.000、0.000、0.000)，同時分析了患者CRP的水平，發(fā)現(xiàn)輸注后CRP也有明顯的升高趨勢(P=0.000)，見表4。比較對照組和伊布替尼組兩組患者輸注CD19 CAR-T細胞后血清中IL-6、IL-8、TNF-α、CRP的表達，發(fā)現(xiàn)伊布替尼組患者各細胞因子表達水平高于對照組患者，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表 5。

表4 26例患者CD19 CAR-T細胞治療前后細胞因子水平及CRP差異比較Tab.4 Comparison of cytokine and CRP level in 26 patients before and after CD19 CAR-T cell therapy [M(P25，P75)]

表5 兩組患者CD19 CAR-T細胞治療后細胞因子水平及CRP差異Tab.5 Comparison of cytokine and CRP level between two groups after CD19 CAR-T cell therapy [M(P25，P75)]

3 討 論

近年來，國內(nèi)外多項臨床試驗證實CAR-T細胞療法在治療難治復發(fā)的淋巴細胞白血病和淋巴瘤中具有顯著療效[15-16]。在本研究中，CD19 CAR-T治療的對照組(n=10)患者總有效率為40%，中位無進展生存期7個月，伊布替尼組(n=16)患者總有效率為87.5%，遠高于對照組。這提示伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T治療與單用CAR-T相比較，能顯著提高難治復發(fā)DLBCL患者的總反應(yīng)率。伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T治療組DLBCL患者總體反應(yīng)率顯著高于單獨CAR-T治療組的主要原因在于： 一方面，伊布替尼可改善患者本身T細胞的耗竭狀態(tài)，增強自身T細胞在體外擴增的能力[17]；另一方面，伊布替尼可以聯(lián)合CAR-T治療可以減少T細胞上免疫抑制信號程序性細胞死亡蛋白-1(progra-mmeddeath-1， PD-1)的表達，同時也減少了B細胞上免疫抑制信號B100的表達。此外，伊布替尼也可促進CAR-T細胞的遷移及療效[18]。本研究中，伊布替尼組患者總體生存與對照組相比無顯著差異，PFS和OS有待提高，可能與病例數(shù)有限，隨訪時間短有關(guān)。CAR-T療法在取得療效的同時，也存在很多不良反應(yīng)，如CRS、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、感染等，其中以CRS最為常見[15]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，CRS發(fā)生率為76.2%，起始于CAR-T細胞輸注后的6～20 d，其中1～4級CRS分別占比為38.1%、9.5%、14.3%、14.3%。本研究對照組10例患者中，7(70%)例患者出現(xiàn)CRS，其中1～4級CRS分別占比為50.0%、20.0%、0%、0%，多發(fā)生于 CAR-T治療后的4～14 d。CRS發(fā)生率及出現(xiàn)時間與既往研究相似，但對照組10例患者未出現(xiàn)3級及3級以上的CRS，推測可能與研究中使用FC方案預(yù)處理降低了淋巴瘤患者腫瘤負荷及嚴密監(jiān)測患者反應(yīng)情況并及時對癥處理有關(guān)。本研究比較了CD19 CAR-T治療對照組和伊布替尼組患者的不良反應(yīng)發(fā)生率，結(jié)果顯示無統(tǒng)計學意義，這提示伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T治療與單用CD19 CAR-T比較，不增加CAR-T的毒副反應(yīng)。

TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10等細胞因子水平變化與CRS診斷密切相關(guān)。本研究比較26例患者治療前后細胞因子表達水平變化發(fā)現(xiàn)，與輸注CD19 CAR-T細胞前相比，26例患者輸注后血清中IL-6、IL-8、TNF-α 水平顯著升高。伊布替尼組患者輸注CD19 CAR-T細胞后血清中IL-6、IL-8、TNF-α和CRP的表達顯著高于對照組患者，這提示伊布替尼不會增加CAR-T治療時CRS相關(guān)炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α及CRP的表達。

綜上所述，口服伊布替尼的患者進行CD19 CAR-T細胞治療后療效顯著，且CRS發(fā)生率與對照組相比無顯著性差異，這表明伊布替尼聯(lián)合CD19 CAR-T細胞治療難治復發(fā) DLBCL具有良好的療效與安全性。由于本研究樣本量較少，且伊布替尼治療與CD19 CAR-T治療存在一定時間間隔，未來仍需擴大伊布替尼與CD19 CAR-T同步治療的臨床樣本進行進一步驗證。