駱曉倩， 周 倩， 孟璐璐， 帥 文， 王 凱， 段 濤

(1. 同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院產(chǎn)科，上海 201204； 2. 同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖免疫科，上海 201204； 3. 同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海 201204)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2次在妊娠20周前的胎兒丟失[1]，是一種極為常見的妊娠并發(fā)癥，大約每300名孕婦中就有1位會發(fā)生RSA[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因復(fù)雜多樣，比如父母染色體異常，母親生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常，自身免疫性疾病，內(nèi)分泌失調(diào)，感染和精神等諸多因素[3-4]。然而，除了這些比較明確的病因外，臨床上仍有將40%～50%的RSA患者病因不明。

蛋白質(zhì)組學(xué)在探索疾病生物標志物和病理生理機制等方面擁有巨大的潛力。本研究通過蛋白組學(xué)方法對RSA相關(guān)的分子信號通路進行綜合性的研究，尋找潛在的分子機制，以期發(fā)現(xiàn)新的分子靶點，從而降低RSA發(fā)生率，提高其診治率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；ECL顯影劑購自Milipore公司；TBST購自生工生物工程(上海)股份有限公司；AT-Ⅲ抗體購自Santa Cruz公司；C3抗體、MRPS7抗體購自Proteintech公司；Beta-actin抗體購自Abcam公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 受試者的納入

本次實驗共收集24個患者的臨床樣本，分為兩個組，即正常對照組和RSA組，每組12個。具體納入標準如下。

1.2.1 正常妊娠期主動終止妊娠組

入選標準： 正常妊娠，年齡為20～40歲，之前有過≥1次的成功妊娠分娩史，無自然流產(chǎn)病史，此次妊娠孕周≤20周，術(shù)前B超提示宮內(nèi)妊娠，胎心胎芽良好，主動要求終止妊娠。

排除標準： 孕婦吸煙酗酒或接受射線藥物等，伴有糖尿病、慢性高血壓、腎病等其他內(nèi)外科疾病，胎兒畸形或伴有染色體異常等。

1.2.2 RSA組

入選標準： 正常妊娠，年齡為20～40歲，此次就診前有過≥1次的自然流產(chǎn)病史，此次妊娠自然流產(chǎn)孕周≤20周，術(shù)前經(jīng)陰道超聲提示宮內(nèi)妊娠，無胎心搏動，主動要求終止妊娠。

排除標準： 術(shù)后絨毛芯片檢查提示染色體異常(如染色體三體)，患者本身有生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常，自身免疫性疾病，內(nèi)分泌失調(diào)，感染等明確導(dǎo)致RSA發(fā)生的病因，以及有一些內(nèi)科慢性病史，不良煙酒史，藥物服用史等。

上述所有受試者均就診于同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院，標本取自2018年6月—7月來院門診手術(shù)室行清宮手術(shù)的患者，獲取標本前均取得了患者及家屬的知情同意，并通過了同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院倫理委員會的審查(KS18176)。

1.3 樣本的收集和處理

患者在按照嚴格的臨床手術(shù)規(guī)范及無菌操作要求下行常規(guī)清宮術(shù)，收集負壓吸引瓶中的宮腔刮出物，找出絨毛組織，置于預(yù)冷的含HBSS(含1%青霉素雙抗溶液)的離心管中，迅速置入冰盒內(nèi)。

在無菌超凈臺中，取出冰盒內(nèi)的絨毛組織，置于干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，用預(yù)冷的HBSS(含1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液)洗去殘余的血液，剪去殘留的蛻膜等間質(zhì)組織。將絨毛剪成適當大小，分裝于凍存管內(nèi)，做好標記后立即放入液氮中淬滅，然后放入-80 ℃ 冰箱作短期保存。

其中16個樣本(RSA組與正常妊娠組個8個)用于蛋白組學(xué)實驗，剩下8個樣本(RSA組與正常妊娠組各4個)用于Western印跡法。

1.4 蛋白提取

樣品從-80 ℃取出，稱取適量組織樣品至液氮預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末。各組樣品分別加入粉末4倍體積裂解緩沖液(8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制劑和2 mmol/L EDTA)，超聲裂解。4 ℃，12 000 ×g，離心10 min，去除細胞碎片，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。

1.5 胰酶酶解

蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L，56 ℃還原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光孵育15 min。最后將樣品的尿素濃度稀釋至低于2 mol/L。以1∶50的質(zhì)量比例(胰酶∶蛋白)加入胰酶，37 ℃酶解過夜。再以1∶100的質(zhì)量比例(胰酶∶蛋白)加入胰酶，繼續(xù)酶解4 h。

1.6 TMT標記

胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥。以0.5 mol/LTEAB溶解肽段，根據(jù)TMT試劑盒操作說明標記肽段。簡單的操作如下： 標記試劑解凍后用乙腈溶解，與肽段混合后室溫孵育2 h，標記后的肽段混合后除鹽，真空冷凍干燥。

1.7 HPLC分級

肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm粒徑，4.6 mm 內(nèi)徑，250 mm長)。操作如下： 肽段分級梯度為8%～32%乙腈、pH 9，60 min分離60個組分，隨后肽段合并為18個組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥后進行后續(xù)操作。

1.8 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

肽段用液相色譜流動相A相[0.1%(V/V)甲酸水溶液]溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進Orbitrap Fusion質(zhì)譜進行分析。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描(DDA)程序，即在一級掃描后選擇信號強度最高的前10肽段母離子依次進入HCD碰撞池使用35%的碎裂能量進行碎裂，同樣依次進行二級質(zhì)譜分析。

1.9 通路富集分析

采用KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路的富集分析。費歇爾精確雙端檢驗方法被用于檢驗差異表達蛋白在以鑒定到的蛋白為背景。通路富集檢驗P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。最后根據(jù)KEGG網(wǎng)站通路層級分類方法將這些通路進行分類。

1.10 差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)信號分析(IPA)

將包含所有差異表達蛋白質(zhì)的列表(以UniProt編號形式)和差異倍數(shù)值上傳到IPA軟件(2000—2018 QIAGEN)中進行分析。P值在IPA 中基于Right-Tailed Fisher’s Exact Test 算法，可以分析相關(guān)的經(jīng)典通路。

1.11 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析與樞紐蛋白

將342個差異蛋白分子，上傳至STRING網(wǎng)站(https：∥string-db.org/)，將網(wǎng)絡(luò)互作結(jié)果導(dǎo)出。再將導(dǎo)出的string_interactions.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，運用cytohubba插件，挑選出前20個樞紐蛋白。從這20個樞紐蛋白挑選出屬于3個富集最明顯KEGG通路中的蛋白。

1.12 Western印記法

將另外8個樣品從-80 ℃取出，置入液氮中研磨，將研磨好的粉末置于1.5 mL的EP管中，按比例加入蛋白裂解液，用超聲破碎儀超聲約10 s，使蛋白充分裂解。將組織置于冰上裂解30 min，4 ℃，13 700×g，離心20 min。取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白，按比例加入蛋白上樣緩沖液95 ℃煮沸10 min。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃ 搖床孵育過夜，TBST洗膜3次后加入 HRP二抗(1∶ 2 000)室溫搖床孵育2 h，繼續(xù) TBST洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對條帶進行分析。

將曝光所得的條帶裁剪好，通過Image J軟件分析條帶的灰度值，然后以β-actin 作為內(nèi)參條帶，用目標蛋白的灰度值/β-actin得出該蛋白的相對灰度值。

1.13 統(tǒng)計方法

采用雙樣本、雙尾t檢驗來比較蛋白表達，P<0.05、差異倍數(shù)>1.2時差異有統(tǒng)計學(xué)意義；其他數(shù)據(jù)均使用Prism GraphPad進行統(tǒng)計分析；采用非參數(shù)t檢驗來分析組間比較的統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達的蛋白質(zhì)

本項研究一共鑒定到6 438個蛋白質(zhì)，其中5 697 個蛋白質(zhì)包含定量信息。以1.2倍為變化閾值，P<0.05為標準，在定量到的蛋白質(zhì)中，RSA/Normal比較組中,鑒定出342個差異表達的蛋白，其中208個蛋白表達發(fā)生上調(diào)，134個蛋白表達發(fā)生下調(diào)。

2.2 差異表達蛋白的信號通路分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫的富集分析表明，上調(diào)的差異表達蛋白涉及7個富集較明顯的通路，包括補體和凝血級聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、百日咳、朊病毒病、膽固醇代謝和利什曼病；其中補體級聯(lián)和凝血級聯(lián)富集程度最高，見圖1A。在下調(diào)的差異表達蛋白中得到了三條富集通路;即核糖體、類固醇生物合成和胰島素信號通路，其中核糖體通路富集最為顯著，見圖1B。另外在所有的富集通路中，補體級聯(lián)和凝血級聯(lián)，以及核糖體通路中富集到的蛋白數(shù)目也是最多的，見圖1C。

圖1 所有差異蛋白的KEGG通路富集分析Fig.1 Graphic representation of the enrichment of differentially expressed proteins based on KEGG pathway analysisA： 所有上調(diào)差異蛋白的KEGG通路富集分析柱狀圖；B： 所有下調(diào)差異蛋白的KEGG通路富集分析柱狀圖，橫軸數(shù)值為顯著P值(P<0.05)的負對數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的值越大則此功能類型的富集越顯著；C： 所有差異表達蛋白的富集分析氣泡圖，氣泡直徑大小與該通路涉及到的差異蛋白數(shù)目成正相關(guān)

2.3 差異表達蛋白的信號網(wǎng)絡(luò)分析

以-log(P-value)進行排名，列出本次分析中最相關(guān)的經(jīng)典通路(前20個)，-log(P-value)表示該通路在提交數(shù)據(jù)集中的富集程度，值越大表明富集程度越明顯，相關(guān)性越強。從圖2中可以看出，補體系統(tǒng)在所提交的數(shù)據(jù)集中富集程度最高。

2.4 樞紐蛋白的驗證

通過Cytoscape中的cytohubba插件，基于MCC(Maximal Clique Centrality)算法得出各個樞紐蛋白的score值，score值越大，表示該節(jié)點蛋白在整個網(wǎng)絡(luò)中占的權(quán)重越大，取依次排名前20的節(jié)點，在20個樞紐蛋白中，有3個蛋白分別屬于富集最明顯的補體系統(tǒng)，凝血級聯(lián)以及核糖體通路，分別是C3、AT-Ⅲ(即SERPINC1)、MRPS7，見表1。Western印跡法結(jié)果顯示，屬于ribosome通路中的蛋白MRPS7在RSA組中下調(diào)，而在complement and coagulation這個通路里的2個蛋白C3和AT-Ⅲ在RSA組中明顯上調(diào)，見圖3。

圖3 C3、AT-Ⅲ、MRPS7蛋白在兩組絨毛組織蛋白中的差異表達Fig.3 The protein expression levels of complement component 3, antithrombin-Ⅲmitochondrial ribosomal protein S7 between recurrent spontaneous abortion patients and controlsA： C3、AT-Ⅲ、MRPS7蛋白在正常組對照組與RSA組絨毛組織中表達情況的蛋白印跡圖；B： 三個蛋白差異表達的統(tǒng)計分析；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表1 通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及Cytoscape軟件導(dǎo)出的20個樞紐蛋白Tab.1 Graphical representation of the top 20 hub proteins from the identified differentially expressed proteins, based on protein-protein interaction and Cytoscape software analyses

3 討 論

RSA的病因復(fù)雜多樣，常見的有染色體異常，子宮解剖結(jié)構(gòu)異常，自身免疫性疾病，內(nèi)分泌失調(diào)，宮內(nèi)感染和其他精神神經(jīng)性因素等[1-2]。但是除了染色體異常這一病因比較明確外，臨床上仍有至少40%以上患者病因不明。復(fù)雜的病因造成了RSA的難治性，探索RSA的發(fā)病機制是目前基礎(chǔ)與臨床研究的難點與熱點。

研究表明，補體系統(tǒng)的異常與不良妊娠結(jié)局相關(guān)，如妊娠早期的自然流產(chǎn)，中晚期的子癇前期以及胎兒生長受限等[5]。作為妊娠期間保護母親和胎兒免受感染的補償性機制，補體系統(tǒng)的生理性活化有助于正常妊娠的維持[6]。而另一方面，胎兒作為同種半移植體能夠與母體共存，免疫耐受在妊娠過程中起著關(guān)鍵作用。胎盤中補體激活過多可能導(dǎo)致胎盤損傷，進一步導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。抑制補體的激活對正常妊娠的維持是必不可少的[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞活力的維持是通過抑制補體系統(tǒng)來實現(xiàn)的，一旦這種抑制狀態(tài)失衡就會導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[8]。

凝血系統(tǒng)的異常也參與RSA的發(fā)病。諸多實驗結(jié)果顯示，促凝血因子和抗凝血因子在RSA中都發(fā)生了上調(diào)。Kim等[9]的報道稱RSA患者卵泡液中的纖維蛋白原和凝血酶都出現(xiàn)了上調(diào)。而Pan等[10]卻發(fā)現(xiàn)，在早期RSA患者的胎盤絨毛中，只有凝血酶原出現(xiàn)了上調(diào)。但其差異也可能是因為后者主要關(guān)注影響早期胚胎生長的相關(guān)蛋白，而未關(guān)注到參與其他功能的纖維蛋白原。

最近的一項研究發(fā)現(xiàn)補體和凝血途徑相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本在RSA組中呈現(xiàn)出下調(diào)[11]。而之前基于2D的蛋白組學(xué)研究結(jié)果也顯示，與正常妊娠組相比，補體C3和抗凝血酶的表達在RSA組中也下調(diào)的[9]。但本實驗結(jié)果卻與之相反，即C3和抗凝血酶在RSA組是上調(diào)的，其原因可能是由于二者實驗使用的方法不同，也有可能是因為實驗取材不同，因為前者實驗對象為卵泡液，卵泡液和胎盤絨毛參與的妊娠階段不同，卵泡液中的蛋白質(zhì)主要參與妊娠早期的卵泡成熟以及卵細胞受精，而胎盤絨毛自胚胎植入子宮內(nèi)膜后，便參與整個妊娠期的維持。由于絨毛組織在正常妊娠的維持中發(fā)揮著重要作用，因此，需要進一步探索胎盤絨毛中補體和凝血途徑與RSA的相關(guān)性。此外，目前已知C3是組織免疫細胞特異性表達的分子，但有研究發(fā)現(xiàn)，C3的轉(zhuǎn)錄本在反復(fù)妊娠丟失的絨毛組織中表達增加[12]，而本實驗也發(fā)現(xiàn)C3在RSA中的胎盤絨毛組織中的表達是上調(diào)的，這導(dǎo)致對C3表達范圍產(chǎn)生了新的思考，即C3這一免疫調(diào)節(jié)分子是否僅局限表達于免疫細胞。

綜上所述，在RSA發(fā)病過程中，補體和凝血系統(tǒng)失調(diào)是與之密切相關(guān)的，但具體是上調(diào)還是下調(diào)還有待進一步闡明和證實。此外，上調(diào)也不完全等于激活，因為補體活化始于參與補體蛋白(比如C3和C5)的級聯(lián)放大的剪切作用，并伴隨著補體的消耗以及蛋白沉積形成膜攻擊復(fù)合物。因此當該系統(tǒng)激活時，也可能表現(xiàn)為補體減少或下調(diào)。該假設(shè)也同樣適用于凝血系統(tǒng)。最后，補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)在妊娠相關(guān)疾病中的致病機制也并不完全獨立，而是相互制衡，又相互促進的。因為在正常生理情況下，免疫細胞和炎性介質(zhì)能夠調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)，反過來，凝血途徑中的一些分子又有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

除了補體和凝血系統(tǒng)的變化，此次研究還發(fā)現(xiàn)核糖體通路在RSA中呈現(xiàn)下調(diào)。Xin等[14]以早期妊娠丟失(early pregnancy loss, EPL)患者為研究對象，用同樣的方法和組織樣本，發(fā)現(xiàn)核糖體功能在EPL中被抑制。另一項研究同樣以絨毛組織為樣本，發(fā)現(xiàn)核糖體通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本在RSA組中呈現(xiàn)明顯下降[12]。核糖體主要參與mRNA翻譯和蛋白質(zhì)生成，這是參與機體代謝中至關(guān)重要的過程[15]。而在本研究中，蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)顯示在總共314個差異蛋白中，其中有213個參與代謝過程的蛋白水平發(fā)生了變化，因而猜測可能是因為核糖體功能受抑制影響了代謝過程，最終導(dǎo)致RSA的發(fā)生。

RSA患者胎盤絨毛組織中鑒定出的差異蛋白能為RSA致病的分子機制研究提供有價值的研究思路。盡管本次實驗結(jié)果與之前報道過的研究有出入，但在鑒定出的結(jié)果中，也有一些不容忽視的共性。因此，為了更充分地闡明RSA的致病機制，有必要使用多種方法以進行相互補充，相互驗證。