王婷婷， 徐仙赟， 張 玲， 宋寧靜*

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院皮膚科，上海 200050； 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 3. 教育部心腦血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

瘙癢是一種引起強(qiáng)烈搔抓意愿的不愉快的感覺[1]，超過6周的瘙癢稱為慢性瘙癢。慢性瘙癢常見于多種皮膚病，如特異性皮炎、銀屑病、結(jié)節(jié)性癢疹等；也可繼發(fā)于系統(tǒng)性疾病、神經(jīng)及精神性疾病等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和身心健康[2]。目前臨床上針對慢性瘙癢的治療主要以口服抗1型組胺受體藥物為主，但常常收效甚微。

紫外線照射已成為皮膚科多種疾病的常規(guī)治療手段。波長在311～313 nm的窄譜中波紫外線(narrow-band ultraviolet B, NB-UVB)因其穿透性強(qiáng)，不易引起皮膚損害而被廣泛應(yīng)用于白癜風(fēng)、銀屑病、皮膚淋巴瘤、特異性皮炎等疾病的治療[3-6]。近年來，NB-UVB在臨床上被證實(shí)是一種對慢性瘙癢有顯著療效、相對安全的物理治療方法，并受到歐洲慢性瘙癢管理指南的推薦[7-8]。但NB-UVB緩解慢性瘙癢的機(jī)制仍不明確。本研究利用慢性瘙癢模型小鼠探究窄譜中波紫外線對慢性瘙癢的作用及其機(jī)制，為NB-UVB的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

4～6周齡雄性C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，體重約20 g。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境提供充足的水、食物及活動空間，保持(22±2 ℃)的溫度，60%～80%的濕度以及12 h的晝夜節(jié)律。所有實(shí)驗(yàn)均按照《同濟(jì)大學(xué)生物研究用動物指南》進(jìn)行，并經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物研究委員會批準(zhǔn)(TJAA08521102)。

1.2 試劑及儀器

丙酮(貨號： 10000418)、鹽酸(貨號： 10011018)、無水乙醇(貨號： 10009218)、二甲苯(貨號： 10023418)、多聚甲醛(貨號： 80096618)、蔗糖(貨號： 10021418國藥)購自國藥集團(tuán)；異氟烷(R510-22)購自瑞沃德公司；DNFB(貨號： D1529)購自Sigma公司；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(貨號： FP205-02)、FastQuant RT Kit(貨號： KR106-03)購自天根生化科技有限公司、DEPC水(貨號： B501005-0500)購自生工生物工程股份有限公司、TRIzol Reagent(貨號： R4801-01)購自Magen公司、IL-10 ELISA試劑盒(貨號： M1000B)購自R&D公司、窄譜中波紫外線治療儀(7 mW/cm2)購自Sigma公司。

1.3 變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis， ACD)的建立

參照并改良文獻(xiàn)[9-10]中ACD的造模方法。提前1天用剃毛器將小鼠頸背部皮膚剃凈、備皮。于第1、4、8、11天，在小鼠頸背部連續(xù)涂抹50 μL的0.15% DNFB丙酮溶液。對照組于相同位置涂抹50 μL的丙酮溶液。涂抹完成后的第1天計(jì)為Day 1(D1)。分別于第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)、第15天(D15)、第21天(D21)觀察小鼠的行為學(xué)及皮損改變。

1.4 窄譜中波紫外線照射方法

按照公式： 輻照劑量(mJ/cm2)=輻照強(qiáng)度(mW/cm2)×輻照時間(s)可計(jì)算出輻照劑量。本實(shí)驗(yàn)選取8、10、12、14 s照射時間，即應(yīng)用56、70、84、96 mJ/cm2的照射劑量照射小鼠頸背部皮膚。照射開始前，使用異氟烷麻醉小鼠，并將其固定在平面上。遮蓋除頸背部以外的其他皮膚，使照射光源位于小鼠頸背部皮膚上方約2 cm的距離，按下按鈕，開始照射。在照射過程中，注意保護(hù)操作者及實(shí)驗(yàn)動物的眼睛。于ACD造模成功后第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)、第9天(D9)、第11天(D11)、第13天(D13)、第15天(D15)進(jìn)行照射干預(yù)。對照組小鼠同樣給予麻醉及固定處理，但不照射。每一次照射應(yīng)位于皮損觀察及行為學(xué)數(shù)據(jù)采集之后。在第15天測量指標(biāo)收集完畢后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取下局部皮膚，放入固定液中或液氮保存。

1.5 正常小鼠最小紅斑量(minimal erythema dose, MED)的確定

提前1天將正常8～12周齡雄性C57BL/6小鼠頸背部備皮，應(yīng)用70、84、96 mJ/cm2照射劑量的窄譜中波紫外線照射小鼠備皮處皮膚。于24 h候后觀察小鼠局部皮膚改變，并取照射局部皮膚放入固定液中。

1.6 組織病理學(xué)觀察

放入固定液中的皮膚修剪、脫水、石蠟包埋、切片、H-E染色后，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.7 瘙癢行為學(xué)檢測

參考文獻(xiàn)[11]和[12]所述，小鼠后爪抬起撓抓造模部位，并放下，計(jì)為1次瘙癢行為。在測量行為前，保證周圍環(huán)境安靜，讓小鼠在鼠籠中適應(yīng)30 min后開始記錄。使用錄像機(jī)記錄下小鼠45 min的行為，采用雙盲法由人工計(jì)數(shù)。

1.8 qPCR

取小鼠頸背部皮膚，剪成小塊狀放入盛有TRIzol的EP管中。提取出皮膚中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)為cDNA,依次為模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]，使用以下引物，組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase)引物： 上游序列： 5′-CGTGAATACTACCGAGCTAGAGG-3′；下游序列： 5′-ACTCGTTCAATGTCCCCAAAG-3′；GAPDH引物： 上游序列： 下游序列： 5′-GAGTGTTTCCTCG-TCCCGTA-3′；下游序列： 5′-TCACCCCATTTGAT-GTTAGT-3′。配制10 μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃，600 s，重復(fù)1次；95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s，重復(fù)45次；72 ℃延伸600 s。以2-ΔΔCT計(jì)算樣品中目的基因的表達(dá)量。

1.9 ELISA

皮膚組織按照10 ul/mg加入裂解液并研磨，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min, 4 ℃，離心半徑13.5 cm，離心15 min, 取上清液進(jìn)行ELISA檢測。ELISA檢測按照R&D試劑盒說明書進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做3復(fù)孔。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本OD值計(jì)算樣本IL-10的含量(pg/mL)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 確定正常小鼠MED

觀察3種不同劑量(70、84、96 mJ/cm2)的NB-UVB照射C57BL/6小鼠24 h后頸背部皮膚變化，可發(fā)現(xiàn)： 70 mJ/cm2NB-UVB照射24 h后，小鼠頸背部皮膚無明顯改變；84 mJ/cm2NB-UVB照射24 h后，小鼠頸背部皮膚可見輕度紅斑及脫屑；H-E染色提示表皮輕度增厚；膠原方向改變，呈毛玻璃樣；真皮輕度水腫；96 mJ/cm2NB-UVB照射24 h后，小鼠頸背部皮膚可見紅斑及脫屑；H-E染色提示表皮增厚；真皮輕度水腫(圖1)。由此可確定窄譜中波紫外線對于正常8～12周齡C57BL/6小鼠頸背部皮膚MED約為84 mJ/cm2。

圖1 3種不同劑量NB-UVB照射小鼠頸背部皮膚24 h后變化Fig.1 Changes in the dorsal neck skin of mice irradiated with three different doses of NB-UVB after 24 hA： 照射24 h前后大體對比圖片；B： 照射24 h前后組織病理對比圖片；每組動物為3只，共9只小鼠

2.2 建立ACD慢性瘙癢小鼠模型

與之前的研究[9，14]類似，在11 d內(nèi)反復(fù)涂抹0.15% DNFB丙酮溶液(圖2A)可成功建立ACD慢性瘙癢小鼠模型。與對照組相比，從造模結(jié)束后第1天開始，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)劇烈的自發(fā)搔抓行為，且可持續(xù)至3周(圖2B)。從大體上看，在造模成功后第3天，實(shí)驗(yàn)組小鼠頸背部皮膚出現(xiàn)紅斑、結(jié)痂、滲出等炎癥性改變；在造模成功后第15天，實(shí)驗(yàn)組小鼠頸背部皮膚炎癥性改變有所緩解，可見瘢痕、鱗屑等慢性改變。

圖2 ACD模型小鼠局部皮膚外觀及瘙癢行為的改變Fig.2 Changes in the appearance of the local skin and scratching behavior after the ACD model successfully establishedA： ACD造模流程圖；B： ACD造模實(shí)驗(yàn)組和對照組瘙癢行為對比圖；C： ACD造模實(shí)驗(yàn)組和對照組頸背部皮膚大體皮損改變對比圖；每組動物為7只，共14只小鼠；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05

2.3 窄譜中波紫外線對于ACD小鼠皮損及瘙癢行為的影響

正常8～12周齡C57BL/6小鼠頸背部皮膚NB-UVB-MED約為84 mJ/cm2(圖1)。為防止紅斑反應(yīng)加劇皮損部位的炎癥，本實(shí)驗(yàn)選取NB-UVB-MED的70%對模型組進(jìn)行干預(yù)，與臨床實(shí)際應(yīng)用相適應(yīng)[4]。分別用0、56、70 mJ/cm2能量NB-UVB照射模型組小鼠頸背部的皮膚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 與對照組相比，56 mJ/cm2能量NB-UVB照射可于第13、15天緩解模型組小鼠的瘙癢行為(圖3B)；與對照組相比，70 mJ/cm2能量NB-UVB照射可于第3、5、7、9、11、13、15天緩解模型組小鼠的瘙癢行為(圖3B)；肉眼觀，70 mJ/cm2組在第3天明顯緩解小鼠炎癥反應(yīng)(圖3C)。

圖3 不同劑量NB-UVB對模型組小鼠局部皮膚與瘙癢行為的影響Fig.3 Effects of different doses of NB-UVB on local skin and scratching behavior of ACD miceA： NB-UVB干預(yù)流程圖；B： NB-UVB干預(yù)實(shí)驗(yàn)組和對照組瘙癢行為對比圖；C： 70 mJ/cm2NB-UVB干預(yù)實(shí)驗(yàn)組和對照組頸背部皮膚大體皮損改變對比圖；每組動物為8只，共16只小鼠；56 mJ/cm2與0 mJ/cm2相比，*P<0.05； 70 mJ/cm2與0 mJ/cm2相比，#P<0.05

2.4 窄譜中波紫外線緩解慢性瘙癢的機(jī)制

采用qPCR和ELISA方法對NB-UVB干預(yù)實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行分子水平的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 70 mJ/cm2能量NB-UVB干預(yù)組皮膚中IL-10的含量顯著上升(圖4A)；70 mJ/cm2能量NB-UVB干預(yù)組皮膚中組氨酸脫羧酶的mRNA含量顯著下降(圖4B)。

圖4 NB-UVB干預(yù)組小鼠局部皮膚中IL-10及HDC含量的變化Fig.4 Changes of IL-10 and HDC content in local skin of ACD mice after NB-UVB interventionA： 70 mJ/cm2 NB-UVB干預(yù)組與對照組皮膚中IL-10含量的比較，每組4只小鼠，共8只小鼠；B： 70 mJ/cm2 NB-UVB干預(yù)組與對照組皮膚中組氨酸脫羧酶的mRNA含量的比較，每組9只小鼠，共18只小鼠；**P<0.01

3 討 論

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NB-UVB對于DNFB誘導(dǎo)的慢性瘙癢的緩解作用。此模型經(jīng)常被應(yīng)用于慢性瘙癢的研究[15-16]，常被認(rèn)為是特異性皮炎[17]或者ACD[18]小鼠模型。DNFB作為一種半抗原，可誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，引發(fā)皮膚炎癥。在皮膚水平，多種細(xì)胞、致炎物質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子等參與了慢性瘙癢的形成[19]。有研究表明，組胺依賴的瘙癢和非組胺依賴的瘙癢均參與了DNFB誘導(dǎo)的慢性瘙癢的形成[16]。也有研究提示DNFB誘導(dǎo)的慢性瘙癢小鼠皮膚內(nèi)可被P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽標(biāo)記的肽能神經(jīng)纖維的數(shù)量顯著增加[15]。

在特定光源及距離下，使照射部位產(chǎn)生肉眼可見紅斑的最小照射光劑量稱為MED[20]。通過大體觀察及H-E病理分析可初步確定窄譜中波紫外線對于正常8～12周齡C57BL/6雄性小鼠頸背部皮膚MED約為84 mJ/cm2，這與朱彥君[21]等的研究結(jié)果相近。臨床上，在使用窄譜中波紫外線治療之前，常常需要測量個體的窄譜中波紫外線MED，以了解個體對光療的耐受程度及確定治療的初始劑量，避免因紫外線能量過大造成的不必要的損害。

組胺是常見的致癢物質(zhì)，由肥大細(xì)胞脫顆粒后，釋放到組織中，并發(fā)揮作用，引起組胺依賴的瘙癢。組胺與外周神經(jīng)纖維上1型和4型組胺受體相結(jié)合，產(chǎn)生動作電位，傳遞瘙癢感覺。組氨酸脫羧酶是組胺合成的關(guān)鍵酶，其mRNA含量可間接反應(yīng)組織中組胺的含量[13]。IL-10主要由Th2型細(xì)胞分泌，可抑制Th1型細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)，抑制炎癥。有研究表明在接觸性皮炎的慢性瘙癢可能與皮損中IL-10的含量負(fù)相關(guān)[22]。

當(dāng)應(yīng)用70 mJ/cm2劑量的NB-UVB對DNFB誘導(dǎo)的慢性瘙癢模型進(jìn)行干預(yù)時，可在第3、5、7、9、11、13、15天觀察到小鼠瘙癢行為顯著減少，皮膚炎癥明顯減輕?？赡軝C(jī)制是NB-UVB抑制了肥大細(xì)胞的脫顆粒，減少了致癢物質(zhì)組胺的產(chǎn)生，且NB-UVB促進(jìn)Th2型免疫細(xì)胞釋放IL-10，抑制局部炎癥，進(jìn)而減輕了瘙癢。

在臨床上，NB-UVB已被用于慢性瘙癢的管理，但關(guān)于其機(jī)制研究較少。使用NB-UVB治療時，特定能量的紫外光被直接用于照射皮損部位，進(jìn)而達(dá)到改善皮損、緩解瘙癢的治療效果。因此，猜測NB-UVB的作用部位可能主要位于外周。瘙癢的產(chǎn)生依賴于外周多種因素對于外周神經(jīng)纖維的刺激。瘙癢的傳遞依賴于抗原提呈細(xì)胞對于抗原的提呈作用；依賴于局部皮損中組胺的濃度及不同類型組胺受體的分布；依賴于多種細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子形成的信息傳遞網(wǎng)絡(luò)；也依賴于外周神經(jīng)形態(tài)及分布密度。NB-UVB可能通過多條途徑緩解慢性瘙癢癥狀。