劉 靜， 孫 潔， 曹 浩， 梅天笑

張一帆1,3， 樂(lè)文俊1,3#, 劉中民1,3,5#

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院燒傷整形外科，北京 100045； 3. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)基地，上海 200123； 4. 上海市血液中心，上海 200051； 5. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心外科，上海 200120)

目前，極具潛力的干細(xì)胞治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種臨床疾病中，成為醫(yī)學(xué)研究最前沿和最熱門(mén)的研究方向之一[1]。1967年，F(xiàn)riedenstein教授首次從骨髓中發(fā)現(xiàn)并分離出一種具有自我更新能力的貼壁細(xì)胞，由于這些細(xì)胞能分化為中胚層來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞，因此稱(chēng)之為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)[2]。而后，從骨髓[3]、牙髓[4]、臍帶[5]以及脂肪[6]等各種廣泛組織中都分離得到大量的MSCs。其中人臍帶來(lái)源的MSCs(umbilical cord-derived mese-nchymal stem cells， UCMSCs)作為圍產(chǎn)期組織來(lái)源的細(xì)胞，因具有更多的原始表型、更長(zhǎng)的端粒酶和活性、更高的產(chǎn)量、更短的倍增時(shí)間、取材方便、倫理學(xué)爭(zhēng)議小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐步應(yīng)用于臨床前和臨床研究[7-8]。

磁性二氧化硅納米微球(magnetic silica nano-spheres， MSNPs)具有特有的超順磁性、磁靶向性和生物相容性等特點(diǎn)[9]，近些年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛能。例如，在腫瘤治療研究領(lǐng)域，通過(guò)MSNPs標(biāo)記細(xì)胞藥物，可利用基于其超順磁性的磁共振成像，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞藥物的體內(nèi)示蹤，并在外加磁場(chǎng)下增強(qiáng)藥物在腫瘤部位的富集，提升殺傷腫瘤細(xì)胞的效果[10]；另外，經(jīng)抗體、引物表面修飾后的MSNPs能高效地從復(fù)雜生物樣品中分離蛋白質(zhì)、核酸等目標(biāo)成分，以用于下一步研究。除此之外，用于治療心肌梗死、中風(fēng)等疾病的干細(xì)胞，由于移植到體內(nèi)后存活率很低，嚴(yán)重影響治療效果，而MSNPs可通過(guò)材料本身或負(fù)載活性物質(zhì)(如自由基清除劑、小分子藥物等)來(lái)改善干細(xì)胞活性、增強(qiáng)干細(xì)胞的旁分泌等功能，進(jìn)而提高干細(xì)胞的治療效果[11]。另外，MSNPs也可以作為一種標(biāo)記干細(xì)胞的探針，示蹤干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的命運(yùn)[12]。MSNPs不僅有望成為MSCs體內(nèi)移植的示蹤標(biāo)記物，而且還能介導(dǎo)MSCs活性來(lái)提升對(duì)疾病治療效果。基于此，本研究旨在探究MSNPs對(duì)UCMSCs體外增殖、遷移等生物學(xué)活性的影響，為進(jìn)一步研究MSNPs標(biāo)記UCMSCs的體內(nèi)移植治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中臍帶組織的供者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)： 【2017】體臨審第(001)號(hào)修正2。

α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒、三系分化試劑等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；流式抗體CD34、CD45、CD73、CD90購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 UCMSCs的分離和原代培養(yǎng)過(guò)程

1.2.1 UCMSCs的分離 本實(shí)驗(yàn)UCMSCs原代培養(yǎng)采用的是組織塊培養(yǎng)法。首先將獲得的臍帶組織放入含有雙抗的生理鹽水中，4 ℃條件下運(yùn)輸?shù)紾MP實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)中棄去臍帶保存液，在75%乙醇中振蕩浸泡2 min，然后用生理鹽水不斷沖洗臍帶。接著將臍帶組織放置于10 cm培養(yǎng)皿中，將其剪碎為2～3 cm的節(jié)段并洗去臍帶中殘留的血液。最后用無(wú)菌鑷剔除臍帶中的臍靜脈和臍動(dòng)脈(1根臍靜脈、2根臍動(dòng)脈)并分離出華通膠，將其剪碎為1 cm2左右的組織塊。

1.2.2 UCMSCs的原代培養(yǎng) 挑取上述組織塊平鋪于T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。組織塊鋪板后，每5 d更換1次α-MEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)顯微鏡觀察組織塊周邊，約2周后組織塊周邊可爬出長(zhǎng)梭形UCMSCs。待原代UCMSCs生長(zhǎng)接近匯合80%，用胰酶消化3～5 min至UCMSCs回縮，收集UCMSCs，500×g，離心5 min，去上清液，以1∶2/1∶4比例接種至新的培養(yǎng)瓶中，并標(biāo)記為第1代。平均每2～3 d換液，至UCMSCs融合80%傳代，以此類(lèi)推。

1.2.3 UCMSCs的制備流程 流程包括取材、分離、剪切、接種、培養(yǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 原代培養(yǎng)UCMSCs的制備流程Fig.1 The preparation process of primary cultured UCMSCs

1.3 UCMSCs的細(xì)胞鑒定方法

1.3.1 UCMSCs的表面標(biāo)志物鑒定 取第4～5代UCMSCs，PBS清洗，用胰酶在37 ℃ 條件下消化3～5 min至UCMSCs回縮，立即加入α-MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集UCMSCs，500×g，離心5 min，去上清液。用PBS清洗UCMSCs 1～2次，500×g，離心5 min。然后用PBS重懸UCMSCs，加入不同的流式管中。分別加入抗人的CD34/CD45、CD73/CD90抗體，每個(gè)樣本加5 μL抗體，設(shè)立空白對(duì)照組?；靹驑颖痉胖糜? ℃，避光孵育30 min。在UCMSCs中加入PBS重懸，500×g，離心5 min，去除未結(jié)合到UCMSCs的抗體。將PBS加入U(xiǎn)CMSCs重懸，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)UCMSCs表面標(biāo)志物。流式結(jié)果用Flow Jo軟件分析。

1.3.2 UCMSCs的三系分化鑒定 取4.5×105個(gè)UCMSCs接種到6孔板中，放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至UCMSCs貼壁。待UCMSCs擴(kuò)增至接近融合，將6孔板中換為成骨或成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。每2～3 d更換成骨或成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1次，倒置顯微鏡下觀察UCMSCs的形態(tài)。

1.3.3 UCMSCs的茜素紅染色和成骨分化UCMSCs培養(yǎng)3周后，用4%多聚甲醛固定液固定30 min，PBS清洗后，將茜素紅染液加入U(xiǎn)CMSCs中，染色30 min。然后吸去茜素紅溶液，PBS清洗后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察和拍攝UCMSCs成骨誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

1.3.4 UCMSCs的油紅O染色和成脂分化 油紅O染液配制： 油紅O粉末完全溶于無(wú)水乙醇為儲(chǔ)存液。將油紅O儲(chǔ)存液與蒸餾水按3∶2混勻，用中性濾紙過(guò)濾即為工作液。UCMSCs培養(yǎng)3周后，用4%多聚甲醛固定液固定30 min，PBS清洗后，將油紅O工作液加入U(xiǎn)CMSCs中，染色30 min。而后吸去油紅O工作液，PBS清洗后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察和拍攝UCMSCs成脂誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

1.3.5 UCMSCs的阿利新藍(lán)染色和成軟骨分化取5×107個(gè)UCMSCs懸液(用α-MEM完全培養(yǎng)基重懸)滴于24孔板的中央，形成細(xì)胞微團(tuán)，放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24 h后向24孔板中滴加成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。UCMSCs微團(tuán)大約每2～3 d換成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1次，倒置顯微鏡下觀察UCMSCs形態(tài)。UCMSCs微團(tuán)培養(yǎng)3周后，用4%多聚甲醛固定液固定30 min，PBS清洗后，將阿利新藍(lán)染液加入U(xiǎn)CMSCs微團(tuán)中，染色30 min。而后吸去阿利新藍(lán)溶液，PBS清洗后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察和拍攝UCMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

1.4 MSNPs的制備與表征

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的溶劑熱法和St?ber方法[13]制備MSNPs，流程如下： 在磁攪拌下將2.56 g乙酸鈉和0.81 g FeCl3·6H2O溶解在30 mL乙二醇中，轉(zhuǎn)至高壓釜中200 ℃下加熱10 h，混合物用乙醇和離子水各洗滌3次，將上述產(chǎn)物分散在70%乙醇中，轉(zhuǎn)移至250 mL反應(yīng)瓶，用NH4Cl調(diào)節(jié)pH至9.5，在劇烈攪拌下加入100 μL TEOS，反應(yīng)12 h后，用乙醇和去離子水各洗滌3次，烘干獲得MSNPs粉末，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，若往反應(yīng)體系中添加的是羅丹明B異硫氰酸酯，則產(chǎn)物是紅色熒光的MSNPs；如果不需要熒光標(biāo)記，則這反應(yīng)過(guò)程中不添加熒光染料。

采用透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)MSNPs的尺寸和形貌進(jìn)行表征。紅色熒光標(biāo)記MSNPs的情況將通過(guò)熒光顯微鏡目視檢查。同時(shí)，使用馬爾文電位儀可測(cè)量MSNPs在pH=7 條件下的微球表面電位。

1.5 MSNPs標(biāo)記UCMSCs

先取一定量MSNPs粉末配制成2 mg/mL的溶液。每次使用前，須經(jīng)超聲分散后，用PBS分別稀釋配制成1、10、50、100、200 μg/mL濃度梯度的MSNPs溶液。然后，往等細(xì)胞量的UCMSCs懸液中加入不同濃度的MSNPs，在冰浴下共孵育30 min，再在磁力架上進(jìn)行磁分離，用PBS洗滌2次，去除未被標(biāo)記的UCMSCs，收集剩余的細(xì)胞即獲得MSNPs標(biāo)記的UCMSCs。采用熒光倒置顯微成像和流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)MSNPs對(duì)UCMSCs的細(xì)胞形態(tài)和表面干性標(biāo)志物的影響。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法評(píng)價(jià)UCMSCs的增殖能力。將帶有不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、200 μg/mL)MSNPs的UCMSCs以1×104個(gè)/孔種植于96孔板中(對(duì)照組為UCMSCs)，培養(yǎng)24 h后，按照試劑說(shuō)明書(shū)，以10 μL CCK-8溶液添加進(jìn)每個(gè)孔中，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h。用酶標(biāo)儀讀取每個(gè)孔在450 nm下的光密度值(D450)。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法[14]： 將含有不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、200 μg/mL)MSNPs的UCMSCs以1×106個(gè)/孔種植于6孔板中(對(duì)照組為UCMSCs)，而后37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合80%，用滅菌過(guò)的10 μL槍頭垂直于細(xì)胞進(jìn)行劃痕，劃一條干凈的直線(xiàn)邊緣。然后分別在培養(yǎng)后0、6、12、24 h將6孔板放置于顯微鏡下，取劃痕周?chē)?個(gè)視野觀察UCMSCs的遷移情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)的UCMSCs的細(xì)胞形態(tài)觀察

供者的臍帶組織通過(guò)組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行分離和鋪板，約2周后組織塊周邊可爬出UCMSCs，繼續(xù)培養(yǎng)約1周，UCMSCs數(shù)量明顯增多。而后待UCMSCs達(dá)到80%匯合后進(jìn)行消化和傳代。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)原代培養(yǎng)的UCMSCs貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖2A。

2.2 原代培養(yǎng)UCMSCs的干細(xì)胞特性鑒定

UCMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，可見(jiàn)細(xì)胞核縮小或偏向細(xì)胞一側(cè)，通過(guò)油紅O染色，低倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不一、數(shù)量不等的橙紅色空泡樣脂滴，見(jiàn)圖2B。UCMSCs經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，可見(jiàn)細(xì)胞呈立方形或不規(guī)則形態(tài)，通過(guò)茜素紅染色，低倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面大量片狀橘紅色鈣化結(jié)節(jié)斑塊，見(jiàn)圖2C。UCMSCs經(jīng)過(guò)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，可見(jiàn)細(xì)胞呈球形，通過(guò)阿利新藍(lán)染色，圓球著藍(lán)色，見(jiàn)圖2D。

UCMSCs經(jīng)胰酶消化獲得懸浮細(xì)胞，而后與相應(yīng)的抗體結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，UCMSCs的表面標(biāo)志物CD90和CD73表達(dá)為陽(yáng)性，UCMSCs的表面標(biāo)志物CD34和CD45表達(dá)為陰性，見(jiàn)圖2E。

圖2 原代培養(yǎng)UCMSCs的干細(xì)胞特性鑒定Fig.2 Characterization of stem cells of primary cultured UCMSCsA： 倒置顯微鏡下UCMSCs細(xì)胞形態(tài)；B： UCMSCs成脂分化；C： UCMSCs成骨分化；D： UCMSCs成軟骨分化；E： 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)UCMSCs表面標(biāo)志物

2.3 MSNPs的制備與表征

MSNPs的包硅修飾是改善磁性納米材料生物相容性的關(guān)鍵步驟。為了獲得生物相容性好和包裹均勻的MSNPs，本研究精確調(diào)控硅烷化試劑(如TEOS)在堿性溶液中水解的速率。如果水解過(guò)快，則容易產(chǎn)生單純的二氧化硅微球；如果水解過(guò)慢，則會(huì)出現(xiàn)磁性材料相互粘連，不利于獲得分散性高、粒徑均勻的MSNPs。本研究通過(guò)TEM和SEM，監(jiān)控了反應(yīng)過(guò)程中二氧化硅修飾的進(jìn)展。通過(guò)優(yōu)化物料配比，本研究獲得的MSNPs粒徑為200～300 nm，見(jiàn)圖3A、3B。同時(shí)，使用馬爾文電位分析儀測(cè)試MSNPs的表面電荷情況，結(jié)果表明MSNPs的平均電位為(-27±2) mV，且它們都能均勻地分散在水或緩沖液中，可穩(wěn)定存放12個(gè)月而不結(jié)團(tuán)塊，同時(shí)還保持良好的分散性能。

圖3 磁性二氧化硅納米微球的表征Fig.3 Characterization of magnetic silica nanospheresA： MSNPs的透射電鏡圖；B： MSNPs的掃描電鏡圖

2.4 MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、200 μg/mL)MSNPs與UCMSCs共孵育，通過(guò)磁分離獲得標(biāo)記的細(xì)胞，再放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)不同濃度MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)其細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響，標(biāo)記的UCMSCs依然保持長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，增大微球質(zhì)量濃度至200 μg/mL也沒(méi)有觀察到細(xì)胞皺縮，變形等異常形態(tài)變化，見(jiàn)圖4A。

同時(shí)，采用活細(xì)胞標(biāo)記染料Hoechst 33342(0.2 μg/mL，C1029，碧云天公司)與MSNPs標(biāo)記的UCMSCs共孵育30 min，讓細(xì)胞核被標(biāo)記藍(lán)色。在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)紅色熒光MSNPs成功吸附在藍(lán)色細(xì)胞核標(biāo)記的UCMSCs上，見(jiàn)圖4B。

圖4 MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4 The effect of MSNPs on cell morphology of the labeled UCMSCsA： 倒置顯微鏡下，不同濃度MSNPs-UCMSCs細(xì)胞形態(tài)的典型圖像；B： 熒光顯微鏡下，10 μg/mL MSNPs-UCMSCs細(xì)胞形態(tài)的典型圖像

2.5 MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)細(xì)胞表面干性標(biāo)志物的影響

將質(zhì)量濃度為10 μg/mL的MSNPs標(biāo)記在UCMSCs上，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至第4～5代時(shí)，將標(biāo)記的干細(xì)胞用胰酶消化獲得干細(xì)胞懸浮液，而后與相應(yīng)的干細(xì)胞標(biāo)志物抗體孵育結(jié)合，洗滌去干擾后進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。MSNPs標(biāo)記的UCMSCs細(xì)胞表面的干性標(biāo)志物CD90和CD73表達(dá)依然呈陽(yáng)性，同時(shí)，表面標(biāo)志物CD34和CD45表達(dá)也保持陰性，則與對(duì)照組中未經(jīng)標(biāo)記的UCMSCs的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明一定劑量下的MSNPs標(biāo)記對(duì)UCMSCs表面干性標(biāo)志物的表達(dá)無(wú)明顯干擾。

圖5 MSNPs標(biāo)記UCMSCs后對(duì)其細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)影響Fig.5 MSNPs affects the expression of cell surface markers of labeled UCMSCs

2.6 MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響

將不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、200 μg/mL)MSNPs標(biāo)記在UCMSCs上后，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h。CCK-8細(xì)胞增殖結(jié)果表明： MSNPs在質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)能夠促進(jìn)UCMSCs的增殖，然而隨著質(zhì)量濃度(10、50、100、200 μg/mL)的增大，MSNPs對(duì)UCMSCs的增殖存在抑制作用，且抑制作用隨著微球劑量增大而增強(qiáng)，見(jiàn)圖6A。

另外，在本研究中選擇10 μg/mL MSNPs作為代表濃度，考察了其標(biāo)記UCMSCs對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。同上述流程一樣，依次經(jīng)過(guò)共孵育和磁分離，獲得該濃度劑量標(biāo)記的UCMSCs，然后，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合80%，用滅菌過(guò)的10 μL槍頭垂直于細(xì)胞進(jìn)行劃痕，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。然后分別在0、6、12、24 h將6孔板放置于顯微鏡下，取劃痕周?chē)?個(gè)視野觀察UCMSCs的遷移情況。通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可以觀察到不同培養(yǎng)時(shí)間下MSNPs標(biāo)記對(duì)UCMSCs的遷移能力的干擾情況，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)圖6B。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在10 μg/mL質(zhì)量濃度下MSNPs標(biāo)記UCMSCs沒(méi)有對(duì)其細(xì)胞遷移能力造成明顯干擾。

圖6 MSNPs標(biāo)記UCMSCs對(duì)其增殖和遷移的影響Fig.6 The effect of MSNPs on cell proliferation and migration of labeled UCMSCsA： 不同濃度的MSNPs-UCMSCs的細(xì)胞增殖結(jié)果，UCMSCs為對(duì)照組；B： 10 μg/mL MSNPs-UCMSCs的細(xì)胞遷移結(jié)果

3 討 論

研究報(bào)道，作為前沿的MSCs治療具有歸巢到損傷部位組織，發(fā)揮促炎或抗炎等免疫調(diào)控，刺激血管新生等生物學(xué)作用，從而用于治療各種臨床疾病，如血液病、移植物抗宿主病、糖尿病、炎癥性疾病、心血管疾病、骨和軟骨疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病等[15-16]。骨髓來(lái)源的MSCs(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)被最先和最廣泛應(yīng)用于臨床前和臨床研究中，而后脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells， ATMSCs)和UCMSCs也進(jìn)入了臨床前和臨床研究中。BMMSCs雖然作為目前在臨床治療中應(yīng)用最多的MSCs類(lèi)型，但它仍具有一些局限性。首先，患者自身來(lái)源的BMMSCs必須通過(guò)骨髓抽取這種有創(chuàng)操作來(lái)獲取，這可能會(huì)導(dǎo)致一些并發(fā)癥。對(duì)健康志愿者通過(guò)有創(chuàng)性骨髓抽取活檢來(lái)獲得同種異體來(lái)源的BMMSCs也面臨倫理問(wèn)題。其次，骨髓抽取出的BMMSCs的最初細(xì)胞含量很低，需要通過(guò)擴(kuò)增到很多代才能達(dá)到細(xì)胞治療數(shù)量。而長(zhǎng)時(shí)間的體外擴(kuò)增過(guò)程，可能使BMMSCs的功能和質(zhì)量下降[17]。

UCMSCs的來(lái)源是臍帶，而臍帶作為分娩的醫(yī)療廢物，不需要活檢等有創(chuàng)性操作，其倫理性問(wèn)題爭(zhēng)議也相對(duì)較小。2006年，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(the Interna-tional Society for Cellular Therapy, ISCT)提出鑒定MSCs最低的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)： (1) 在體外培養(yǎng)中，長(zhǎng)梭形的MSCs呈貼壁生長(zhǎng)；(2) MSCs表面標(biāo)志物CD73、CD105、CD90、CD29等表達(dá)陽(yáng)性，表面標(biāo)志物CD11b，CD34、CD45、CD79α、HLA-DR等幾乎不表達(dá)；(3) 具有成骨、成脂、成軟骨的三系分化潛能[18]。

MSNPs主要用于生物樣本的分離純化、細(xì)胞的標(biāo)記和成像等。有研究報(bào)道磁性納米微球可以標(biāo)記MSCs中實(shí)現(xiàn)核磁成像[19]。超順磁性氧化鐵納米微球可以經(jīng)過(guò)表面修飾降低其生物毒性[20]。此外，磁性納米微球是一種生物相容性較好的MRI造影劑，可對(duì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和代謝評(píng)估，為干細(xì)胞移植治療的可視化控制提供新的思路。因此，探究磁性二氧化硅納米微球?qū)CMSCs的表面干性標(biāo)志物表達(dá)、細(xì)胞增殖、遷移等活性影響，對(duì)發(fā)展穩(wěn)定的UCMSCs標(biāo)記物具有重要意義。

本研究首先通過(guò)組織塊培養(yǎng)法成功分離和原代培養(yǎng)出人UCMSCs，接著依次采用顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和三系分化等技術(shù)手段鑒定原代培養(yǎng)的上述細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的基本特性。其次，將不同質(zhì)量濃度的MSNPs溶液與UCMSCs共孵育與磁分離，獲得MSNPs標(biāo)記的UCMSCs。最后，通過(guò)熒光倒置顯微鏡成像、流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞增殖試劑盒和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等技術(shù)手段評(píng)估了MSNPs標(biāo)記對(duì)UCMSCs的細(xì)胞形態(tài)、表面干性標(biāo)志物表達(dá)、細(xì)胞增殖和遷移能力等干擾情況。

綜上所述，磁性二氧化硅納米微球有望成為UCMSCs的納米標(biāo)記物，然而其在體內(nèi)模型中評(píng)估其對(duì)UCMSCs的分布、遷移、歸巢、療效等生物學(xué)特性影響尚需深入研究。