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        元七膠囊改善小鼠失眠的機(jī)制

        2021-05-14 00:47:44隋得志高麗莎王斌勝
        關(guān)鍵詞:低劑量膠囊受體

        隋得志 李 然 李 巖 趙 巖 管 桐 高麗莎 王斌勝

        1 濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003; 2 煙臺(tái)市中醫(yī)院 山東 煙臺(tái) 264001;3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603

        失眠主要是指睡眠持續(xù)時(shí)間不足和(或)睡眠質(zhì)量差,其特征為入睡困難和難以保持睡眠[1]。根據(jù)美國睡眠協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示,美國有5 000萬到7 000萬成年人患有睡眠障礙,每年與失眠相關(guān)造成的損失超過1 000億美元[2]。失眠不僅發(fā)病率高,長(zhǎng)期失眠還會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)生活質(zhì)量的感知差,甚至導(dǎo)致抑郁癥、高血壓、2型糖尿病等[3-6]。更有Meta分析顯示,失眠與死亡增加有相關(guān)性[7]。

        失眠在《內(nèi)經(jīng)》中稱為“目不瞑”、“不得眠”、“不得臥”,與陰陽失衡、營(yíng)衛(wèi)失度、五臟不安等有關(guān),治療以半夏秫米湯、朱砂安神丸、酸棗仁湯、炙甘草湯、黃連溫膽湯、安神定志丸等為主。

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),失眠與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的代謝異常有明顯的相關(guān)性[8]。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),起著廣泛的抑制調(diào)節(jié)作用,可引起深慢波睡眠量增加,巴比妥類和苯二氮卓類安眠藥都是基于GABA受體介導(dǎo)的抑制過程發(fā)揮作用[9-10]。

        元七膠囊是王斌勝教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下經(jīng)過多年的臨床摸索研制而成,該方由三七、元胡兩味藥等比例組成,針對(duì)長(zhǎng)期的、不明原因的失眠可以有效地改善失眠患者的睡眠持續(xù)時(shí)間短、入睡困難、睡眠紊亂等,臨床療效確切。但元七膠囊改善失眠的具體作用機(jī)制尚不清楚,本文擬進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要藥品、試劑和設(shè)備 SPF級(jí)昆明小鼠150只,雄性,體質(zhì)量為18~22 g,購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)原則和濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。

        元胡(批號(hào)為160701,北京同仁堂)、三七(批號(hào)為20160702,北京同仁堂),4-氯-DL-苯基丙氨酸(批號(hào)為S27337,上海源葉生物科技有限公司),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(R0010,索萊寶,北京),小鼠GABA ELISA試劑盒(ml001894,Mlbio,上海),兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體(bs-1232R,Bioss,Beijing),beta-actin抗體(60009-1-Ig,Proteintech),羊HRP-結(jié)合Affinipure 抗兔IgG抗體(SA00001-2,Proteintech)。

        全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美谷分子儀器,上海),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Clinx,上海)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 動(dòng)物造模及分組 將150只昆明小鼠隨機(jī)分為5組,每組30只,分別為正常組、模型組、元七膠囊低劑量組、元七膠囊中劑量組和元七膠囊高劑量組。除正常組外,其他4組首先采用以下方法將正常昆明小鼠制備成失眠模型小鼠:將50 mg NaHCO3片劑溶于1 mL蒸餾水,配成 5% NaHCO3水溶液,與0.9%NaCl溶液混合,調(diào)整pH值至7~8,加入對(duì)氯苯丙氧酸(para-chlorophenylalanine,PCPA)并在混勻儀上充分混勻,使PCPA的濃度為30 mg/mL。每日清晨,按照PCPA 300 mg/kg的劑量腹腔注射PCPA混懸液,連續(xù)注射2 d,正常組小鼠注射同等體積的生理鹽水。第一次注射PCPA混懸液36 h后,小鼠出現(xiàn)煩躁不安、飲水增加、進(jìn)食減少、晝夜節(jié)律消失等,提示造模成功。

        造模成功后,正常組、模型組給予生理鹽水,元七膠囊低劑量組給予元七膠囊0.39 mg/g,元七膠囊中劑量組給予元七膠囊0.78 mg/g,元七膠囊高劑量組給予元七膠囊1.56 mg/g。每日清晨7∶00—8∶00灌胃,一天一次,連續(xù)5 d。

        1.2.2 戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn) 第5天灌胃結(jié)束1 h后,各組隨機(jī)取6只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉,給藥劑量為0.04 mg/g,觀察并記錄小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間。

        取材

        1.2.3 小鼠血清及腦組織提取 各組小鼠摘眼球采血,將血液收集到2 mL EP管中,離心管中,室溫靜置30 min后,12 000 rpm×30 min離心分離血清,-80℃凍存?zhèn)溆茫粚⑿∈筇幩篮?,置于冰面上取腦,同時(shí)迅速剝?nèi)⌒∈竽X組織,液氮快速冷凍,放入-80℃冰箱備用。

        1.2.4 ELISA檢測(cè) 采用雙抗體夾心法檢測(cè)小鼠血清中GABA的含量。按照8、4、2、1、0.5、0 μmol/ L的濃度梯度向標(biāo)準(zhǔn)樣品孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,取10 μL待測(cè)樣品稀釋5倍后加入樣品孔,向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔中加入100 μL酶標(biāo)試劑后用封板膜將96孔板封好,37℃溫育60 min;用單蒸水稀釋20倍配成的濃縮洗滌液洗滌后向每個(gè)孔中加入50 μL顯色劑A溶液,再加入50 μL顯色劑B溶液,在37℃下避光顯色15 min后每孔加入50 μL終止液,反應(yīng)停止。加入終止液后15 min內(nèi),空白孔調(diào)零,用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度值(OD值)。

        1.2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 稱取一定量的腦組織樣品加入適量裂解液,勻漿后冰上裂解30 min,4℃離心,14 000 rpm×10 min,取上清,待用。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明進(jìn)行操作,將25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用0.9%Nacl配制成0.5 mg/mL,定容至100 μL,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。電泳在80 V 30 min和120 V 60 min的條件下進(jìn)行,轉(zhuǎn)膜在275 mA 90 min條件下進(jìn)行。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗(兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體,1∶1000)4℃過夜孵育,TBST緩沖液洗滌3次,每次15 min,室溫孵育二抗(1∶1000)2 h,TBST緩沖液洗滌3次,每次15 min,用Alpha Imager 2200儀器采集圖像。

        2 結(jié)果

        2.1 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間的影響 與模型組相比,元七膠囊處理各組小鼠的睡眠潛伏期均縮短,P<0.05;同時(shí)與模型組相比,元七膠囊處理各組小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間均延長(zhǎng),P<0.01(圖1)。

        圖1 A.元七膠囊可縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期;圖1 B. 元七膠囊可延長(zhǎng)失眠小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間。A. 正常組;B. 模型組;C. 低劑量組;D. 中劑量組;E. 高劑量組。與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖1 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間的影響

        2.2 元七膠囊對(duì)失眠小鼠血清內(nèi)的GABA含量的影響 使用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中GABA含量,結(jié)果顯示,模型組小鼠血清中GABA的含量低于正常組,P<0.05;低、中劑量元七膠囊治療組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高(低劑量組P<0.05,中劑量組P<0.01);高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

        A. 正常組;B. 模型組;C. 低劑量組;D. 中劑量組;E. 高劑量組。與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖2 元七膠囊對(duì)失眠小鼠血清內(nèi)的GABA含量的影響

        2.3 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的GABA蛋白表達(dá)的影響 使用Western Blot檢測(cè)小鼠GABA蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠GABA蛋白表達(dá)下降;與模型組相比,元七膠囊中、高劑量治療組GABA蛋白表達(dá)明顯增加,這提示元七膠囊可能通過促進(jìn)GABA蛋白的表達(dá)來改善模型小鼠的失眠狀況(圖3)。

        A. 正常組;B. 模型組;C. 低劑量組;D. 中劑量組;E. 高劑量組。圖3 元七膠囊的失眠小鼠的GABA蛋白表達(dá)的影響

        3 討論

        GABA為抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用,其含量升高可使失眠患者睡眠時(shí)間延長(zhǎng),從而提高睡眠質(zhì)量[11]。而有關(guān)GABA神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的睡眠調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜,GABA受體共有3個(gè)亞型,即GABAA、GABAB、GABAC受體,三種受體在受到刺激時(shí)具有相似的催眠作用[12]。GABAA受體是一個(gè)Cl-孔,具有巴比妥類藥物、苯二氮卓類藥物和神經(jīng)類固醇的結(jié)合位點(diǎn)。而GABAC受體也由包含一個(gè)Cl-孔的三部分組成,對(duì)GABA的敏感性較GABAA受體和GABAB受體更高,且脫敏過程要慢得多。當(dāng)受到抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA刺激后,Cl-通道開放頻率增加,導(dǎo)致大量的Cl-內(nèi)流,引起突觸后膜超極化后抑制神經(jīng)元放電,減少單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)的釋放而導(dǎo)致睡眠。

        改善失眠藥物的評(píng)價(jià)通常以戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)為主要方法[13]。本研究發(fā)現(xiàn),元七膠囊可以縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期并能延長(zhǎng)失眠小鼠的睡眠時(shí)間,證實(shí)了元七膠囊的療效。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,本研究檢測(cè)小鼠血清中GABA的含量發(fā)現(xiàn),低、中劑量組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高,高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高,而Western Blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了元七膠囊治療后小鼠腦組織中GABA含量的升高。故本研究認(rèn)為,元七膠囊改善失眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)GABA表達(dá)有關(guān)。

        元七膠囊臨床療效確切,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示出其良好的效果,但是對(duì)其作用機(jī)制的研究尚不夠深入,后期將運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究正常小鼠、失眠小鼠以及元七膠囊治療后小鼠蛋白表達(dá)的差異,并對(duì)差異蛋白進(jìn)行深入分析,以探究元七膠囊的作用途徑。

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