陳凱明，李焱，薛一濤

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

高血壓病作為一種慢性疾病，以動脈血壓增高為主要特征，持續(xù)高動力性循環(huán)狀態(tài)將出現(xiàn)一系列心、腦、腎等靶器官的損傷。目前我國成人高血壓病發(fā)病率為27.9%，與此同時正常高值血壓人群出現(xiàn)逐年增長趨勢[1]?！?020國際高血壓學(xué)會全球高血壓實踐指南》[2]結(jié)合全球的流行病學(xué)特征，立足不同國家和地區(qū)經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療資源水平，針對性提出了“基本”及“理想”兩個血壓管理標(biāo)準(zhǔn)，重點強(qiáng)調(diào)了“降血壓是硬道理”的觀點。循證醫(yī)學(xué)和臨床研究進(jìn)一步表明，西藥仍是當(dāng)下調(diào)控血壓，減少靶器官損害的主體。相較其不良反應(yīng)，中醫(yī)藥在防治高血壓病的進(jìn)程中發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢[3]。尤其是經(jīng)方以其獨(dú)特的辨證體系，針對高血壓病的致病特點，提出了火邪上擾、氣機(jī)逆亂、痰飲內(nèi)阻3個高血壓病的病機(jī)特點[4]。臨床上大柴胡湯、半夏白術(shù)天麻湯、真武湯等系列經(jīng)典名方在“方證相應(yīng)”的指導(dǎo)下，對于高血壓病的治療發(fā)揮了良好的功效[5]。

大柴胡湯源于《傷寒論》，為主治少陽、陽明合病的代表方，主治胸脅苦滿，嘔不止，郁郁微煩，心下痞硬，或心下滿痛，大便不解[6]。以少陽樞機(jī)不利，郁熱內(nèi)結(jié)為主要病機(jī)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》載：“逆春氣則少陽不升，肝氣內(nèi)變?！备文懲旧訇柕纳l(fā)系統(tǒng)，若肝膽之氣失于升發(fā)，則肝氣內(nèi)郁，郁而為病，出現(xiàn)化火、生風(fēng)、動血等證候?！坝惺亲C，用是方”，對于臨床上表現(xiàn)為眩暈、頭痛、煩躁易怒、胸脅不適、腹?jié)M等肝郁化火的高血壓病患者，用大柴胡湯疏肝解郁，通腹瀉熱往往取得良效。然而，目前大柴胡湯治療高血壓病僅限于文獻(xiàn)研究和臨床報道，缺少分子、基因?qū)用娴纳钊胙芯俊１狙芯繉⒔柚W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)、全面地揭示大柴胡湯的作用機(jī)制，探索更多的降血壓通路，更好發(fā)揮中醫(yī)藥對高血壓病的防治作用[7]。

1 資料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分篩選和潛在靶點檢索借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)[8]篩選出柴胡、黃芩、半夏、枳實、芍藥、大黃、生姜、大棗所含化學(xué)成分。以同時符合口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.18為主要藥代動力學(xué)參數(shù)，篩選出8味藥物的主要活性成分[9-11]。將收集到的有效成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫檢索SMILE結(jié)構(gòu)，根據(jù)“配體之間相似性分布”原理采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索成分對應(yīng)靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)蛋白-靶點之間標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化。

1.2 大柴胡湯“藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)一體化構(gòu)建為了構(gòu)建“藥物-化合物-靶點”一體化網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape3.6.1生物可視化軟件，充分展示藥物、化合物、靶點三者之間交互作用關(guān)系[12]。

1.3 高血壓病靶點預(yù)測以“Hypertension”為關(guān)鍵詞分別在OMIM、GAD、DisGeNET、PharmGKB、TTD、DrugBank 6個不同的數(shù)據(jù)庫中檢索高血壓病相關(guān)靶點，整合檢索結(jié)果，刪除重復(fù)靶點，構(gòu)建高血壓病靶點數(shù)據(jù)庫[13]。

1.4 直接作用靶點獲得及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將活性成分靶點與上述構(gòu)建的高血壓病靶點通過在線bioinformatics工具繪制藥物-疾病韋恩圖，并分析得到大柴胡湯治療高血壓病的映射靶點。將成分-疾病映射靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI構(gòu)建，將置信度0.7(high confidence)作為設(shè)定閾值，分析得到蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 拓?fù)浞治龊完P(guān)建靶點篩選在生物學(xué)進(jìn)程中，關(guān)鍵基因往往調(diào)控并影響其他基因功能的發(fā)揮[14]。將PPI數(shù)據(jù)以tsv格式導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，運(yùn)用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)；根據(jù)自由度(Degree)、介數(shù)(Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)3個主要參數(shù)進(jìn)行拓?fù)浜Y選，得到關(guān)鍵靶點[15]。

1.6 基因GO富集分析和KEGG信號通路分析利用Cytoscape3.6.1中的ClueGO插件，以(P<0.01)為閾值，對直接作用靶點進(jìn)行分子功能(Molecular Function)、細(xì)胞組成(Cellular Component)富集分析；生物過程(Biological Process)運(yùn)用 Funrich version3軟件[16]，進(jìn)行通路注釋。通路富集分析采用經(jīng)典的Davidv在線分析工具對直接作用靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.01作為條件進(jìn)行篩選，根據(jù)每條通路富集基因的數(shù)量，篩選出具有顯著差異的作用通路。

2 結(jié)果

2.1 大柴胡湯主要活性成分和預(yù)測靶點TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到8味中藥相關(guān)活性成分760個，進(jìn)行ADME篩選，刪除重復(fù)成分，整合得到97個主要活性成分。參照相關(guān)的藥理學(xué)報道，列舉每味藥物代表性化合物的基本信息，見表1。例如MOL0358(β-谷甾醇)是生姜、大棗、白芍、半夏 大黃和黃芩共有的化合物；MOL0098(槲皮素)是大棗、柴胡共有的化合物；而MOL0422(山柰酚)是柴胡和白芍共有的潛在化合物。

表1 大柴胡湯中20個代表性化合物信息表

2.2 大柴胡湯“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建通過Cytoscape 3.6.1可視化軟件充分展示了“藥物-化合物-靶點”三者之間的網(wǎng)絡(luò)圖，大柴胡湯97個主要活性成分，與170個成分對應(yīng)的靶點存在 2 640 條互作關(guān)系，“中藥-化合物 -靶點”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

圖1 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 高血壓病主要靶點根據(jù)人類遺傳、疾病基因、藥物基因組學(xué)基因的不同特性，在6個不同的數(shù)據(jù)庫中檢索到“Hypertension”相關(guān)基因共1 757個，進(jìn)行整合分析，刪除共有靶點，得到1 169個高血壓病靶點。

2.4 直接作用靶點篩選170個活性成分靶點與 1 169 個高血壓病相關(guān)靶點相互映射，最終得到84個成分-疾病直接作用靶點，見圖2。

圖2 活性成分-疾病直接作用靶點圖

2.5 大柴胡湯PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點拓?fù)浜Y選通過String數(shù)據(jù)庫，建立84個直接作用靶點蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將String中下載的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1，采用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到一個由79個節(jié)點和218條邊組成的網(wǎng)絡(luò)(圖3A)。第一次篩選以Degree(DC)、介數(shù)(BC)和接近中心性(CC)大于中位數(shù)進(jìn)行篩選，得到22個節(jié)點和76條邊的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3B)；二次篩選以Degree大于中位數(shù)的2倍進(jìn)一步篩選，最終構(gòu)建11個節(jié)點和37條邊的大柴胡湯作用于高血壓的核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖3C)。用節(jié)點的大小表示Degree的大小，11個關(guān)鍵靶點依次為：IL-6、PTGS2、EGF、VEGFA、JUN、IL-1β、TNF、NOS3、F2、HMOX1、HTR2C詳見表2。

表2 大柴胡湯治療高血壓關(guān)鍵靶點基本信息表

注：A直接作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；B根據(jù)度(DC)、介數(shù)(DC)和接近中心性(CC)第一次篩選后網(wǎng)絡(luò)圖；C在第一次刪選基礎(chǔ)上根據(jù)度(DC)進(jìn)一步篩選網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 大柴胡湯直接作用靶點GO功能富集分析通過對直接作用靶點GO富集分析發(fā)現(xiàn)，分子層面主要涉及蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)活性、酶結(jié)合、受體結(jié)合等方面；細(xì)胞組成層面主要涉及細(xì)胞質(zhì)膜、膜的組成、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞溶質(zhì)等，見圖4。運(yùn)用Funrich version3分析84個直接作用靶點的生物過程，主要涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞訊息傳遞、能量通道、新陳代謝等，見圖5。

注：A分子功能；B細(xì)胞組成

圖5 大柴胡湯治療高血壓病的生物過程示意圖

2.7 大柴胡湯KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得55條通路，根據(jù)P<0.01篩選得到25條相關(guān)通路，根據(jù)每條通路富集基因的數(shù)量，對前10條通路進(jìn)行可視化處理，見圖6。通過查閱文獻(xiàn)大柴胡湯可能通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、血管表皮生長因子信號通路(vascular endothelial growth factor signaling pathway)等多途徑治療高血壓病。

注：Y軸代表pathway名稱，X軸代表Ratio，氣泡顏色代表富集的顯著性，即P值的大小，氣泡面積基因集中于這個pathway的基因數(shù)量，即Count值

3 討論

中藥藥理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，一定程度上促進(jìn)了中藥及其復(fù)方制劑有效成分對降血壓機(jī)制的研究。目前中醫(yī)防治高血壓病的作用機(jī)制主要從阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進(jìn)、改善胰島素抵抗、抗炎利尿等多個方面發(fā)揮對血壓的調(diào)控作用[17]。與此同時，中藥復(fù)方的復(fù)雜性、藥物基礎(chǔ)不明、基礎(chǔ)與臨床研究脫節(jié)等一系列問題成為深入研究的瓶頸。本研究充分發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)性、整體性的優(yōu)勢，以經(jīng)方大柴胡湯治療高血壓病為切入點，為拓寬中醫(yī)藥防治高血壓病的治療途徑做出有益探索。

分析藥代動力學(xué)篩選結(jié)果，得到大柴胡湯97種性質(zhì)較好具有代表性的化合物。其中β-谷甾醇、兒茶素、黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等多種活性成分均具有良好的抗高血壓相關(guān)作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫等功效，可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)的堆積，增強(qiáng)血管彈性，使血壓下降[18]。白芍、大棗中所含的兒茶素被譽(yù)為“血管穩(wěn)定劑”，通過促進(jìn)NO的釋放，改變內(nèi)皮細(xì)胞的血流動力以及抑制血小板聚集，促進(jìn)血紅素氧化酶的表達(dá)以維持體內(nèi)血壓平衡，具有強(qiáng)效的降血壓活性[19]。本研究也證實了靶點凝血酶、血紅素加氧酶在整個復(fù)方中發(fā)揮重要的降血壓作用。黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等均可通過抑制炎癥免疫反應(yīng)，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接或間接參與抗高血壓病的作用[20-22]。大柴胡湯良好的活性成分為進(jìn)一步探討其抗高血壓病的機(jī)制研究提供藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

結(jié)合KEGG富集所獲得的高血壓病相關(guān)通路與通路上所富集的關(guān)鍵靶點，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯可能通過參與免疫炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能、血管的舒縮、血液流變學(xué)等多個環(huán)節(jié)治療高血壓病。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥因子參與了高血壓病的發(fā)生發(fā)展，高血壓病被視為一種慢性低度炎癥性疾病[23]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-1β、TNF、PTGS2為主的關(guān)鍵靶點均富集在TNF信號通路上，高血壓病的進(jìn)展與發(fā)生可能與炎癥免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān)。臨床研究證實，相比健康人群，高血壓病患者血清中TNF-α和IL-6水平與疾病程度呈正相關(guān)[24]。以往研究表明，TNF-α直接通過細(xì)胞毒性作用，對血管的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。同時TNF-α還可以與血小板源生長因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞和纖維細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6[25]。兩者共同促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，導(dǎo)致血栓形成，控制脂溶酸活性，抑制脂蛋白脂酸活性與脂質(zhì)溶解，脂質(zhì)沉積于血管壁，加速動脈粥樣硬化[26]。近年來，保護(hù)血管內(nèi)皮功能和抑制血管重構(gòu)亦是高血壓病領(lǐng)域研究聚焦的熱點方向[27]。高血壓病患者隨著病程的增長往往伴有血管內(nèi)皮損傷，同時刺激產(chǎn)生和釋放包括內(nèi)皮素在內(nèi)的血管收縮因子以及各種生長因子。內(nèi)皮舒張因子及收縮因子的失衡，促進(jìn)氧化應(yīng)激、激活炎癥反應(yīng)、活化血小板聚集，最終導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙[28]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子通過提高微血管的通透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞滲入，使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移、分化，同時抑制其凋亡[29]。本研究在VEGF signaling pathway信號通路中發(fā)現(xiàn)有大柴胡湯與高血壓病共同直接作用靶點PLA2G4A、PTGS2、VEGFA、NOS3、KDR。因此，推測大柴胡湯可能通過調(diào)節(jié)VEGF signaling pathway通路治療高血壓病。鈣信號通路(Calcium signaling pathway)廣泛參與人體各個生理病理活動。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高是高血壓病形成的重要機(jī)制，血管平滑肌細(xì)胞的收縮是通過鈣離子細(xì)胞形態(tài)實現(xiàn)的。當(dāng)鈣離子通道開放時，平滑肌收縮，相反，選擇性阻斷鈣離子通道可以阻滯鈣離子向細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，平滑肌恢復(fù)松弛，達(dá)到舒張血管和降低血壓的目的[30-31]。其他一些信號通路諸如神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)，通過參與自主神經(jīng)和大腦皮層的活動對血壓產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)預(yù)測的關(guān)鍵靶點和通路表明，大柴胡湯治療高血壓的可能機(jī)制：①參與炎癥反應(yīng)、血管舒張、改善血管內(nèi)皮功能等多靶點參與血壓的調(diào)控作用；②通過腫瘤壞死因子信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性受體通路等多通路發(fā)揮降血壓作用。為進(jìn)一步深入探討大柴胡湯治療高血壓的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。由于網(wǎng)絡(luò)模型并不能完全揭示藥物在生物體內(nèi)狀況，因此，分析出的作用靶點和潛在的通路機(jī)制還需進(jìn)一步實驗證實[32]。