李檸君，崔建霞，黃秉娜，蔣佳俊，安長成，王琰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌引起的一種真菌病害，在溫度高、濕度大的條件下容易發(fā)生，是世界上分布廣、危害大的水稻病害之一。當(dāng)前由于氮素化肥使用水平的提升以及矮稈、雜交水稻等特定水稻品種的推廣，紋枯病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，成為制約水稻生產(chǎn)的重要限制因素［1-3］。農(nóng)藥在控制有害生物為害、保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和提高作物產(chǎn)量等方面發(fā)揮著重要作用，但目前利用率降低等問題日漸突出［4］，因此通過新藥研制及劑型創(chuàng)新等方法提高農(nóng)藥利用率，減少農(nóng)藥使用量成為現(xiàn)代農(nóng)藥發(fā)展的必經(jīng)之路。其中，以納米囊化技術(shù)為代表的納米技術(shù)的發(fā)展為農(nóng)藥新劑型的研制提供了思路。納米農(nóng)藥具有靶向性強(qiáng)、緩控釋、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，此外由于其小尺寸效應(yīng)和大比表面積，在提高農(nóng)藥葉面沉積和展布方面也具有明顯的優(yōu)勢，是當(dāng)前綠色環(huán)保劑型的研究熱點(diǎn)［5-7］。使用微囊劑防治水稻紋枯病有利于延長藥效、提高穩(wěn)定性、減少施藥次數(shù)和農(nóng)藥用量［8］。目前，以納米微囊劑為代表的納米農(nóng)藥在材料、制備方法、結(jié)構(gòu)等方面取得了較大的發(fā)展。關(guān)文勛等［9］利用阿維菌素具有的2個活性羥基，連續(xù)與丙烯酰氯、四乙烯五胺和琥珀酸酐反應(yīng)，制備了帶有酯鍵并對藥物親和的乳化劑前體，乳化劑前體經(jīng)中和后，可以與阿維菌素在水中自發(fā)形成穩(wěn)定的納米農(nóng)藥乳液，顯示出一系列的優(yōu)良性能和更好的殺蟲效果；納米乳液的粒徑可以通過改變?nèi)橐狠d藥量或乳化劑中和程度來調(diào)節(jié)。張大俠等［10］以多壁碳納米管與檸檬酸聚合物的復(fù)合材料為載體對代森鋅和代森錳鋅進(jìn)行包覆，成功將大顆粒的農(nóng)藥轉(zhuǎn)變成納米農(nóng)藥。閻建輝等［11］用硬脂酸對Ag／TiO2表面進(jìn)行了改性，其表面由親水性變?yōu)橛H油性，將溴蟲腈農(nóng)藥、改性Ag／TiO2和相應(yīng)的添加劑混合制成顆粒分布較均勻、平均粒徑為100 nm的納米農(nóng)藥制劑；在田間藥效對比試驗(yàn)中，施藥劑量減少一半條件下，納米制劑防治甘藍(lán)斜紋夜蛾的田間防效優(yōu)于溴蟲腈乳油。

井岡霉素是一種放線菌產(chǎn)生的抗生素，具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性，易被菌體細(xì)胞吸收、傳導(dǎo)，從而干擾和抑制菌體細(xì)胞生長發(fā)育，是我國防治水稻紋枯病應(yīng)用時間較長的農(nóng)藥，但多年持續(xù)、重復(fù)的使用其利用率降低，成為亟待解決的問題［12］；噻呋酰胺是一種新型苯酰胺類低毒廣譜型殺菌劑，具有很強(qiáng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，殺菌效力高，持效期長，主要抑制病菌三羧酸循環(huán)中的酸去氫酶，對由立枯絲核菌屬引起的紋枯病有良好的防治效果，是當(dāng)前防治水稻紋枯病的新型藥劑［13-15］。本研究選用使用時間較久的井岡霉素和新藥代表噻呋酰胺為研究對象，旨在改善藥劑性能的同時，推廣新型殺菌劑。本試驗(yàn)通過W／O／W 復(fù)乳法結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)分別制備了井岡霉素和噻呋酰胺兩種農(nóng)藥納米劑型，對其粒徑、形貌、葉面粘附性以及室內(nèi)殺菌活性進(jìn)行了探究，旨在為提高農(nóng)藥利用率提供研究思路與技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

聚乙烯醇（PVA，87% ～90%，Mw＝30 000～70 000），上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；聚羧酸鹽，江蘇擎宇化工科技有限公司；井岡霉素A（60%）原藥、噻呋酰胺（95%）原藥，北京百樂欣生物科技有限公司；井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品，北京萊伯沃德科技有限公司；噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，北京百靈威科技有限公司；市售5%井岡霉素水劑，江西綠川生物科技實(shí)業(yè)有限公司；市售28%井岡霉素可濕性粉劑，浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司；市售24%噻呋酰胺懸浮劑，日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；二氯甲烷（分析純）、三氯甲烷（分析純），北京化工廠。

供試菌種：立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），北京阿格勒科技有限公司。

Hitachi SU-8010型掃描電鏡、Hitachi HT7700透射電子顯微鏡，日本日立株式會社；Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀，英國馬爾文公司；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；JY92-IIN超聲波粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix Essential 5純水機(jī)，美國密理博公司；RCH-1000磁力攪拌器，日本東京理化器械株式會社；超微量天平，上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；環(huán)境掃描電子顯微鏡，美國賽默飛世爾科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，賽洛捷克科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米微囊的制備 選取安全、可降解、低成本的高分子材料聚乳酸（PLA）作為囊材，通過復(fù)乳法結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)制備納米農(nóng)藥劑型。根據(jù)藥物理化性質(zhì)選擇合適溶劑分別制備相應(yīng)內(nèi)水相和油相，外水相為一定濃度的表面活性劑溶液。以井岡霉素為研究對象時，將井岡霉素A原藥溶于超純水中形成的井岡霉素水溶液作為內(nèi)水相，油相為溶解一定質(zhì)量PLA的二氯甲烷，聚乙烯醇和聚羧酸鹽按照1∶2的比例配置1.3%的表面活性劑溶液得到外水相；以噻呋酰胺為研究對象時，超純水作為內(nèi)水相，將噻呋酰胺原藥、PLA溶解于二氯甲烷中構(gòu)成油相，聚乙烯醇和聚羧酸鹽按照1∶2的比例配置1.3%的表面活性劑溶液得到外水相。

圖1 納米農(nóng)藥劑型制備示意圖

將內(nèi)水相分散在油相中形成W／O型初乳液；在機(jī)械破碎的條件下將W／O型初乳液緩慢滴加到外水相中制備W／O／W 型粗乳液，最后通過高壓均質(zhì)技術(shù)形成均一化乳液。將所得乳液室溫下攪拌揮發(fā)掉有機(jī)溶劑固化成囊，制備得到納米懸浮劑，干燥后得到固體納米微囊劑型（圖1）。

1.2.2 納米微囊的粒徑測定及形貌表征 取少量離心后的固體沉淀用去離子水稀釋至透明狀態(tài)，通過Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀測量納米載藥系統(tǒng)的平均粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI），每個樣品平行測定3次；吸取適量稀釋后的溶液滴于鍍有碳膜的300目銅網(wǎng)以及硅片光滑面上鋪展均勻，室溫狀態(tài)下自然晾干，得到透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡樣品。通過掃描電子顯微鏡對納米微囊的形貌進(jìn)行表征，透射電子顯微鏡對其內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.3 納米微囊的載藥量測定 用超微量天平分別準(zhǔn)確稱量井岡霉素納米載藥系統(tǒng)和噻呋酰胺納米載藥系統(tǒng)凍干粉各10 mg，使其完全溶解于三氯甲烷中并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去多余的溶劑，用90%甲醇浸泡后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，用高效液相色譜（HPLC）法對載藥系統(tǒng)中的藥物濃度進(jìn)行測定。

井岡霉素HPLC測定條件：C18反相柱（250mm ×4.6 mm ×5μm），流動相為0.005 mol／L磷酸氫二鈉-磷酸（用磷酸調(diào)節(jié)pH＝7）+2%甲醇，流速為0.8 mL／min，檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。

噻呋酰胺HPLC測定條件：C18反相柱（250 mm ×4.6 mm ×5μm），流動相為乙腈-水（體積比為7∶3），流速為1.0 mL／min，檢測波長為225 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。

載藥量計(jì)算公式：

1.2.4 納米微囊的葉面展布性能測定 選取疏水性模式作物水稻作為研究對象，以井岡霉素納米微囊為例，探究納米微囊在植株葉面上的鋪展性能。將井岡霉素納米微囊樣品噴灑在水稻植株葉表面，室溫下自然晾干后，通過環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察樣品在葉片上的分布狀態(tài)。

1.2.5 納米微囊的葉面接觸角測定 以水稻為研究對象，以市售井岡霉素水劑和市售噻呋酰胺懸浮劑為對照，通過接觸角測量儀探究兩種納米載藥系統(tǒng)的葉面接觸行為。取大小合適的新鮮水稻葉片用雙面膠固定于載玻片，該過程注意保護(hù)水稻葉片的結(jié)構(gòu)完整。調(diào)整接觸角測量儀視野、參數(shù)至最佳狀態(tài)，通過微量注射器將待測樣品滴加至葉片表面，待藥液穩(wěn)定后立即捕捉藥液與葉片的接觸圖像，通過五點(diǎn)擬合法測定接觸角大小，重復(fù)5次取平均值。

[13][14] HELCOM, Helsinki Convention, http://www.helcom.fi/about-us/convention/.

1.2.6 納米微囊的殺菌活性測定 以立枯絲核菌作為模式真菌，通過菌絲抑制法對井岡霉素納米載藥系統(tǒng)和噻呋酰胺納米載藥系統(tǒng)的室內(nèi)毒力進(jìn)行評價，濃度梯度設(shè)置如表1所示。無菌去離子水加入無菌溶化培養(yǎng)基中作為空白對照；將活化后的立枯絲核菌用直徑為5 mm打孔器壓出生長狀態(tài)相同的菌餅接種于直徑為90 mm的PDA平板中心，每個濃度重復(fù)3次。采用十字交叉法統(tǒng)計(jì)菌落直徑，通過對各樣品生長抑制率和半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）的計(jì)算，分析所制備納米載藥系統(tǒng)的室內(nèi)毒力。

表1 供試藥劑試驗(yàn)濃度

通過下列公式計(jì)算生長抑制率：

其中I是立枯絲核菌生長抑制率；Dc和Dt分別為空白對照組和處理組的菌落直徑；Dd為菌餅直徑（5 mm）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用DPS和SPSS 18.0軟件分別進(jìn)行毒力線性回歸分析和接觸角顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種納米微囊的粒徑分布及形貌表征

井岡霉素納米微囊和噻呋酰胺納米微囊粒徑大小約為300 nm左右，PDI均小于0.3，表明顆粒間分散性良好（圖2）。通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對兩種納米微囊的形貌以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果（圖3）顯示，均呈現(xiàn)分散性良好、表面光滑、形貌規(guī)則的圓球。

圖2 納米微囊的水合粒徑分布

2.2 納米微囊的葉面展布性能

2.3 兩種納米微囊的葉面接觸角分析

改善農(nóng)藥在靶標(biāo)植株上的葉面鋪展性是提高農(nóng)藥有效利用率的方法之一。本試驗(yàn)以疏水性水稻葉片為研究對象，通過接觸角的大小來評估納米微囊在靶標(biāo)植株上的葉面粘附性能。結(jié)果如圖5所示，井岡霉素納米微囊、市售井岡霉素水劑、噻呋酰胺納米微囊以及市售噻呋酰胺懸浮劑在疏水性水稻葉片上的葉面接觸角分別為106.97±1.79°、141.43±2.46°、97.55±1.18°和119.03±10.14°，所制備的納米微囊在疏水性的水稻葉片上有更小的葉面接觸角，且與市售劑型存在顯著性差異（P＜0.05）。表明納米微囊有更好的葉面鋪展性能，從而改善葉片潤濕性，避免因藥液滾落造成農(nóng)藥損失，進(jìn)一步提高農(nóng)藥有效利用率。

圖3 納米微囊的掃描電鏡和透射電鏡圖

圖4 納米微囊在水稻葉片上的分布

圖5 不同殺菌劑在水稻葉面上的接觸角比較

2.4 兩種納米微囊的含藥量及殺菌活性

為驗(yàn)證納米微囊作為新型農(nóng)藥制劑的可行性，對井岡霉素納米載藥體系和噻呋酰胺納米載藥體系的室內(nèi)抑菌活性進(jìn)行探究。井岡霉素納米微囊和噻呋酰胺納米微囊的載藥量分別為9.5%和15.4%。由表2可知，井岡霉素納米微囊、噻呋酰胺納米微囊、市售井岡霉素可濕性粉劑和市售噻呋酰胺懸浮劑的EC50分別為389.5295、3.6872、450.3471μg／mL和5.1871μg／mL，表明兩種納米微囊都具有提高藥效的作用和較好的抑菌效果（圖6）。

表2 不同殺菌劑對立枯絲核菌的殺菌活性

圖6 不同殺菌劑對立枯絲核菌的殺菌效果

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)制備方法與高壓均質(zhì)技術(shù)相結(jié)合，可以將藥劑進(jìn)一步細(xì)化，實(shí)現(xiàn)載藥顆粒高度精細(xì)化，使載藥粒子均勻、穩(wěn)定。且高壓均質(zhì)簡單易操作，能夠?qū)崿F(xiàn)量化生產(chǎn)。Pan等［17］結(jié)合高壓均質(zhì)法制備了5%氯氟氰菊酯納米懸浮液，該懸浮劑粒徑均一，性能穩(wěn)定。

從納米藥劑獨(dú)特的性質(zhì)分析，其具有小尺寸效應(yīng)和大比表面積，可以增加藥液與靶標(biāo)葉面的接觸面積，提高其葉面潤濕性能和分散沉積性能，有利于增強(qiáng)其對靶標(biāo)的作用效率［18］。因此納米農(nóng)藥有潛力成為改善傳統(tǒng)藥劑持效期短、利用率低的重要手段之一，開發(fā)安全高效的納米藥劑也將成為重要的研發(fā)熱點(diǎn)。在防治水稻紋枯病的過程中，開發(fā)納米藥劑不僅僅聚焦在新藥的研發(fā)上，還將以使用時間悠久的傳統(tǒng)藥劑作為對象，利用納米技術(shù)和納米材料對其進(jìn)行改善，提高其利用率。

在本研究中，采用復(fù)乳法結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)分別制備了井岡霉素納米微囊和噻呋酰胺納米微囊，得到的兩種微囊均呈現(xiàn)出形貌均一、分散性良好的球形，且粒徑在300 nm左右，有利于發(fā)揮其小尺寸效應(yīng)。與市售井岡霉素水劑和噻呋酰胺懸浮劑相比，兩種納米微囊具有更好的葉面接觸性能，可以減少因藥液滾落而造成的農(nóng)藥損失，有利于提高農(nóng)藥有效利用率。殺菌活性結(jié)果表明，兩種納米微囊分別比市售井岡霉素可濕性粉劑和市售噻呋酰胺懸浮劑有更高的抑菌活性。

納米技術(shù)不僅為農(nóng)藥的創(chuàng)制提供了新的制備方法，還可以對農(nóng)藥的性能進(jìn)行改善。將農(nóng)藥制備技術(shù)與納米技術(shù)相結(jié)合，利用其小尺寸效應(yīng)等優(yōu)勢改善農(nóng)藥劑型的性能，以提高農(nóng)藥劑型的接觸性能和生物活性等，可以為環(huán)保、高效農(nóng)藥新劑型的發(fā)展提供新思路。