郭 猛，黃 勇，李賀敏，張紅瑞，周 艷，高致明，丁夢瑤

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南 鄭州450018）

在全球范圍內(nèi)，由于灌溉導(dǎo)致的土壤鹽漬化已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要非生物因素之一[1]，我國約有1×108hm2鹽堿地[2]，分布范圍較廣。植物種子在萌發(fā)階段對鹽脅迫的響應(yīng)較其他生育階段更明顯[3-4]，鹽脅迫對種子發(fā)芽率、活力指數(shù)、抗逆酶活性、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、丙二醛 (MDA) 含量、幼苗生長發(fā)育等指標(biāo)均有影響[5-9]。溫度是影響種子萌發(fā)的主要生態(tài)因子之一，其通過改變萌發(fā)種子內(nèi)部酶活性和物質(zhì)代謝進(jìn)程直接決定或間接影響種子萌發(fā)[10]，在一定范圍內(nèi)種子萌發(fā)進(jìn)程會隨溫度的升高而加快[11]，但溫度過高或過低不利于種子萌發(fā)[12-13]，不同植物種子的最適萌發(fā)溫度不同[14-15]。丹參 (Salvia miltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，根及根莖是我國傳統(tǒng)大宗藥材[16]，種植面積在2 萬hm2左右，在我國山東、河南、河北、山西、陜西等半干旱地區(qū)均有分布。丹參種子小、存活時間短，萌發(fā)受土壤鹽堿影響較大[17]。

丹參多分布于半干旱區(qū)丘陵地，土壤鹽堿度較高，以Na+、Cl-、、、等為主；在生產(chǎn)上丹參多采用露天育苗，一般在6 月 - 8 月進(jìn)行，氣溫和地溫均較高。目前，關(guān)于丹參育苗工作的研究集中在提高出苗率和苗期抗逆性等方面[18-19]，但鮮見研究土壤鹽堿和溫度對丹參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[17,20]。以往學(xué)者在研究鹽分或溫度對植物種子萌發(fā)特性、生長和抗逆性等的影響時采用單一鹽脅迫和恒溫處理[21-22]，在自然條件下，溫度是變化的，采用恒溫研究溫度對植物種子萌發(fā)的影響與實(shí)際生產(chǎn)條件不符，另外，鹽堿地中存在多種離子成分，采用單一鹽溶液模擬鹽脅迫也不具有代表性。故本研究采用NaCl 和Na2SO4模擬中性鹽脅迫，采用Na2CO3和NaHCO3模擬堿性鹽脅迫，并設(shè)置18 ℃/28 ℃和28 ℃/38 ℃ 兩種變溫條件，以探究鹽堿、溫度及其交互作用對丹參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，旨在明確丹參種子萌發(fā)在不同溫度下的耐鹽堿閾值，以期為丹參育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試丹參種子 (千粒重為1.35 g)于2018 年6 月采自河南天灃農(nóng)業(yè)科技有限公司澠池縣丹參種植基地，采收后晾干，裝入透氣布袋中，放在4 ℃冰箱內(nèi)保存、備用。試驗(yàn)丹參種子預(yù)先用2.00% H2O2溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018 年7 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材栽培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。該試驗(yàn)設(shè)兩個變溫處理，分別為18 ℃/28 ℃ (t1)和28 ℃/38 ℃ (t2)兩個水平；采用等摩爾質(zhì)量的NaCl 和Na2SO4混合溶液模擬中性鹽脅迫，設(shè)6.25 (Y1)、12.5 (Y2)、25 (Y3)和50 mmol·L-1(Y4)4 個梯度；采用等摩爾質(zhì)量的Na2CO3和NaHCO3混合溶液模擬堿脅迫，設(shè)3.125 (J1)、6.25 (J2)、12.5 (J3)和25 mmol·L-1(J4) 4 個梯度，以清水為對照 (CK)，不同濃度鹽堿溶液pH 如表1 所列。將消毒后的丹參種子擺放于鋪有雙層濾紙的10 cm 玻璃培養(yǎng)皿中，每發(fā)芽床擺放50 粒種子，每培養(yǎng)皿加上述溶液10 mL，對照加蒸餾水10 mL，每處理3 次重復(fù)。用保鮮膜將培養(yǎng)皿密封，防止水分蒸發(fā)，以保持種子萌發(fā)過程中溶液濃度恒定。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為光照時長12 h·d-1，光照強(qiáng)度4 000 lx，相對濕度60%。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，并于第10 天測量幼苗葉長、葉寬、根莖長。CK：清水對照；Y1、 Y2、 Y3和Y4分別表示6.25、12.5、25和50 mmol·L-1鹽脅迫處理； J1、J2、J3和J4分別表示3.125、6.25、12.5和25 mmol·L-1堿脅迫處理；下同。

表 1 不同溫度下不同濃度鹽堿溶液pHTable 1 pH value of saline alkali solutions with different concentrations at different temperatures

CK: water control; Y1, Y2, Y3, and Y4indicate 6.25, 12.5, 25, and 50 mmol·L-1salt treatments, respectively; J1, J2, J3, and J4indicate 3.125, 6.25, 12.5,and 25 mmol·L-1alkali treatments, respectively; this is applicable for the following figures and tables as well.

1.3 指標(biāo)及測量方法

發(fā)芽率 (GR) = 種子發(fā)芽數(shù) (10 d)/供試種子數(shù)×100%； ∑

發(fā)芽指數(shù) (GI) = Gt/Dt。

式中：Gt為第t 日種子萌發(fā)數(shù)；Dt為對應(yīng)的萌發(fā)日數(shù)。

相對鹽害率 = (對照發(fā)芽率 - 處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率× 100%；

發(fā)芽動態(tài) = 當(dāng)天種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)× 100%。

葉長為丹參幼苗最長葉片的長度值，葉寬為丹參幼苗最長葉片的寬度值，苗長為丹參幼苗的根長與莖長之和，數(shù)據(jù)均為10 株平均值。葉長、葉寬和根莖長采用游標(biāo)卡尺測量，以種子露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 27 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。相同溫度下不同鹽堿濃度處理間差異顯著性在95% 置信水平上使用Duncan’s進(jìn)行多重比較，同一鹽堿濃度兩變溫處理間的差異顯著性使用T 檢驗(yàn)得出。運(yùn)用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，所有指標(biāo)數(shù)值均為3 次重復(fù)的平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫、溫度對丹參種子發(fā)芽率的影響

除J4處理外，丹參種子在t1下各處理的發(fā)芽率均顯著大于t2(P ＜ 0.05) (圖1)。鹽溫交互和堿溫交互對丹參種子發(fā)芽率的影響規(guī)律不同，鹽脅迫濃度最大 (Y4)時，兩變溫處理間的發(fā)芽率差值最大，而堿脅迫下兩變溫處理間發(fā)芽率的差值隨脅迫濃度的增加而減小，且堿脅迫濃度最低 (J1)時，兩變溫間發(fā)芽率的差值最大。不同鹽、堿脅迫濃度對丹參種子發(fā)芽率的影響不同，t1條件下Y1處理的種子發(fā)芽率為75.33%，較CK 高11.33%，Y2和J1的發(fā)芽率分別為60.67%和68.67%，與CK 差異不顯著 (P ＞ 0.05)，其余脅迫濃度下丹參種子發(fā)芽率均顯著低于CK (P ＜0.05)；t2條件下CK 的發(fā)芽率為38.00%，Y1、Y2、J1和J2的發(fā)芽率分別為41.33%、32.00%、32.00%和29.33%，與CK 差異不顯著 (P ＞ 0.05)，其余濃度脅迫下的發(fā)芽率均顯著低于CK (P ＜ 0.05)。相同溫度、鹽堿濃度條件下，堿脅迫對丹參種子發(fā)芽率的抑制作用大于鹽脅迫，t1條件下，Y1和J2的發(fā)芽率分別為75.33%和50.00%，Y1顯著大于J2(P ＜ 0.05)；Y2和J3的發(fā)芽率分別為60.67%和23.33%，Y2顯著大于J3(P ＜ 0.05)；Y3和J4的發(fā)芽率分別為46.67% 和3.33%，Y3顯著大于J4(P ＜ 0.05)； t2條件下規(guī)律類似t1。堿溫互作對丹參種子發(fā)芽率均有顯著影響 (P ＜ 0.01)，而鹽溫互作對丹參種子發(fā)芽率的影響不顯著 (P ＞ 0.05) (表2)。

圖 1 不同處理對丹參種子發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of different treatments on germination rate of Salvia miltiorrhiza seeds

2.2 鹽堿脅迫、溫度對丹參種子發(fā)芽指數(shù)的影響

圖 2 不同處理對丹參種子發(fā)芽指數(shù)的影響Figure 2 Effects of different treatments on germination index of Salvia miltiorrhiza seeds

表 2 鹽堿、溫度及其交互對丹參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響Table 2 Effects of salinity, alkalinity, temperature, and their interaction on seed germination and seedling growth of Salvia miltiorrhiza

鹽堿、溫度及其交互作用對丹參種子的發(fā)芽指數(shù)均有顯著影響 (P ＜ 0.05) (表2)，除J3和J4外，t1下各處理的發(fā)芽指數(shù)均顯著大于t2(P ＜ 0.05) (圖2)。在兩種變溫條件下，隨鹽脅迫和堿脅迫濃度的增加，丹參種子發(fā)芽指數(shù)逐漸變小，t1條件下，Y1的發(fā)芽指數(shù)為21.09，顯著高于CK (P ＜ 0.05)，Y2和J1的發(fā)芽指數(shù)分別為16.09 和17.98，均與CK 無顯著差異(P ＞ 0.05)，其余處理的發(fā)芽指數(shù)均顯著小于CK (P ＜0.05)；t2條件下，CK 的發(fā)芽指數(shù)為7.80，Y1、Y2、J1和J2的發(fā)芽指數(shù)分別為7.89、5.34、6.75 和6.58，均與CK 差異不顯著 (P ＞ 0.05)，其余處理均顯著小于CK(P ＜ 0.05)。相同條件下，鹽脅迫對丹參種子發(fā)芽指數(shù)的抑制作用小于堿脅迫，t1條件下，Y1、Y2、Y3的發(fā)芽指數(shù)分別為21.09、16.09 和9.36，J2、J3、J4的發(fā)芽指數(shù)分別為12.34、3.67和0.68，Y1顯著大于J2(P ＜0.05)，Y2顯著大于J3(P ＜ 0.05)，Y3顯著大于J4(P ＜0.05)；t2條件下規(guī)律相同。

2.3 鹽堿脅迫、溫度對丹參種子相對鹽害率的影響

在t1、t2條件下，4 種濃度鹽脅迫處理的相對鹽害率隨脅迫濃度的增加呈逐漸變大趨勢(圖3)，Y1的相對鹽害率最小，在t1和t2下分別為-17.71%和-8.77%，Y4的相對鹽害率最大，在t1、t2下分別為36.46%和92.98%。Y1和Y2處理在兩變溫下的相對鹽害率無顯著差異 ( P ＞ 0.05)，Y3、Y4處理在t1下的相對鹽害率顯著小于t2(P ＜ 0.05)。4 種濃度堿脅迫處理的相對鹽害率隨脅迫濃度的增加也呈增加趨勢，但堿脅迫處理在兩變溫下的相對鹽害率差異不顯著 (P ＞ 0.05)。

圖 3 不同處理對丹參種子相對鹽害率的影響Figure 3 Effect of different treatments on relative salt damage rate of Salvia miltiorrhiza seeds

兩變溫條件下，Y1處理對丹參種子發(fā)芽率有提高作用，故Y1處理在兩變溫條件下的相對鹽害率均為負(fù)值，分別為-17.71%和-8.77%；其余3 個濃度鹽脅迫處理在兩變溫條件下的相對鹽害率均隨鹽脅迫濃度的升高而增加；堿脅迫處理J4在t1、t2下的相對鹽害率分別為94.79% 和96.49%，兩處理間差異不顯著 (P ＞ 0.05)。相同溫度、鹽堿濃度條件下，堿脅迫較鹽脅迫的相對鹽害率更大，t1條件下Y1、J2的相對鹽害率分別為-17.71%和21.88%，J2顯著大于Y1(P ＜ 0.05)，Y2和J3的相對鹽害率分別為5.21%和63.54%，J3顯著大于Y2(P ＜ 0.05)，Y3和J4的相對鹽害率分別為27.08%和94.79%，J4顯著大于Y3(P ＜0.05)；t2條件下的規(guī)律同t1。鹽脅迫、堿脅迫、溫度和鹽溫互作對丹參種子相對鹽害率均有顯著影響 (P ＜0.01) (表2)。

2.4 鹽堿脅迫、溫度對丹參種子發(fā)芽動態(tài)的影響

t1條件下，不同濃度鹽堿脅迫對丹參種子發(fā)芽動態(tài)的影響不同，10 d 時J1和Y1的發(fā)芽率大于CK，其余處理10 d 時的種子發(fā)芽率均低于CK，且濃度越高發(fā)芽率越低，故低濃度鹽堿脅迫對丹參種子發(fā)芽有促進(jìn)作用，高濃度鹽堿脅迫對丹參種子發(fā)芽具有抑制作用 (圖4)。不同處理下丹參種子的發(fā)芽高峰期不同，CK、Y1、Y2、J1和J2在2～4 d 時種子發(fā)芽率增加較快，2～4 d 為發(fā)芽高峰期，隨鹽堿脅迫濃度的增加種子發(fā)芽高峰期推遲，Y3的發(fā)芽高峰期出現(xiàn)在4～6 d，Y4和J3的發(fā)芽高峰期出現(xiàn)更晚，為6～8 d。高濃度堿脅迫嚴(yán)重抑制丹參種子萌發(fā)，發(fā)芽率增加緩慢。在t2條件下，Y1促進(jìn)丹參種子發(fā)芽，其余處理均顯著抑制丹參種子發(fā)芽 (P ＜ 0.05)，且隨鹽堿脅迫濃度的增加，抑制作用增加 (圖5)。在t2條件下， CK、Y1、Y2、J1、J2的發(fā)芽高峰期為4～6 d，Y3和J3的發(fā)芽高峰期為6～8 d，高濃度J4和Y4處理的發(fā)芽率增加較慢，沒有明顯發(fā)芽高峰期。

圖 4 18 ℃/28 ℃條件下鹽、堿脅迫對丹參種子發(fā)芽動態(tài)的影響Figure 4 Effect of salt and alkali stress on seed germination dynamics of Salvia miltiorrhiza at 18 ℃/28 ℃

圖 5 28 ℃/38 ℃條件下鹽、堿脅迫對丹參種子發(fā)芽動態(tài)的影響Figure 5 Effect of salt and alkali stress on seed germination dynamics of Salvia miltiorrhiza at 28 ℃/38 ℃

2.5 鹽堿脅迫、溫度對丹參幼苗生長的影響

兩變溫條件下，除堿溫互作對葉寬無顯著影響外，其他鹽堿脅迫及互作均對丹參幼苗葉長、葉寬和根莖長均有顯著( P ＜ 0.05)和極顯著( P ＜ 0.01)的影響 (表2)。t1條件下J3、J4處理和t2條件下Y4、J3、J4處理嚴(yán)重抑制丹參幼苗葉片生長，其未能正常長出葉片 (表3)。t1條件下，CK 的葉長為0.56 cm，Y3、Y4和J2的葉長均顯著低于CK (P ＜ 0.05)，分別低0.05、0.09 和0.07 cm，Y1、Y2和J1的葉長與CK 無顯著差異 (P ＞ 0.05)；t2條件下，CK 的葉長與Y1的葉長無顯著差異 (P ＞ 0.05)，其余處理的葉長均顯著小于CK (P ＜ 0.05)。t1條件下Y1的葉寬為0.54 cm，顯著大于CK (P ＜ 0.05)，其余處理的葉寬均顯著低于CK (P ＜ 0.05)；t2條 件 下，Y1和J1的 葉 寬 均與CK 無顯著差異 (P ＞ 0.05)，其余處理顯著低于CK (P ＜0.05)。t1、t2條件下，各鹽堿脅迫處理對丹參根和莖的生長均有顯著抑制作用 (P ＜ 0.05)，抑制作用隨脅迫濃度的增加而變大。t1條件下， J4的苗長僅為0.48 cm，較CK 低2.82 cm，差異達(dá)顯著水平。t2條件下鹽堿脅迫對丹參苗長的生長影響規(guī)律與t1類似。

相同溫度、鹽堿脅迫條件下，鹽脅迫對丹參幼苗生長的抑制作用小于堿脅迫，其中t1條件下，Y2處理下丹參幼苗的苗長、葉長和葉寬分別為2.15、0.55、0.41 cm，J3處理的苗長為0.51，無葉長和葉寬，幼苗受堿脅迫抑制更強(qiáng)。

表 3 不同處理對丹參幼苗生長的影響Table 3 Effects of different treatments on seedling growth of Salvia miltiorrhiza

3 討論與結(jié)論

不同植物種子對鹽堿脅迫的響應(yīng)差異較大，李志萍等[5]的研究結(jié)果表明，當(dāng)NaCl 溶液的濃度達(dá)400 mmol·L-1時對栓皮櫟 (Quercus variabilis)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢無顯著影響，而盧艷敏[23]的研究結(jié)果表明當(dāng)NaCl 濃度達(dá)50 mmol·L-1時顯著降低高羊茅 (Festuca arundinacea)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。本研究中，NaCl 和Na2SO4溶液濃度達(dá)到25 mmol·L-1時顯著降低丹參種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。孫西紅等[22]的 研 究 表 明，20 mmol·L-1Na2CO3對4 種 高 羊茅種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均無影響，而本研究中，Na2CO3和NaHCO3溶 液 濃 度 達(dá) 到6.25 mmol·L-1時顯著降低丹參種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。鹽堿脅迫抑制種子發(fā)芽可能由以下原因造成：高濃度鹽堿脅迫增加了溶液的滲透勢，抑制種子萌發(fā)；高濃度鹽堿離子增加了離子毒害，使得一部分種子失活[24-25]，但鹽堿脅迫抑制丹參種子萌發(fā)的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究中，6.25 mmol·L-1的中性鹽溶液可提高丹參種子發(fā)芽率，梁云媚等[26]的試驗(yàn)結(jié)果也表明低濃度的鹽溶液可提高苜蓿 (Medicago sativa)種子的發(fā)芽率，與本研究所得結(jié)論一致。原因可能是萌發(fā)環(huán)境中維持一定的離子濃度有助于種子萌發(fā)，低濃度離子含量有助于維持細(xì)胞膜滲透調(diào)節(jié)，或?qū)粑赣幸欢ǖ募ぐl(fā)作用[27]。

本研究中，相同條件下堿脅迫對丹參種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和幼苗生長的抑制作用大于鹽脅迫，相關(guān)研究也表明，在相同條件下堿脅迫對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用大于鹽脅迫[28-29]。高濃度的堿脅迫使得丹參種子僅有根長出，未能正常長出葉片，這表明堿脅迫對丹參幼苗地上部生長的抑制作用大于地下部，相關(guān)研究也表明鹽堿脅迫對植株地上部生長的抑制作用大于地下部[30]。因?yàn)楦邼舛葔A溶液除了有離子毒害、離子吸收不平衡和滲透脅迫作用外，還增高了溶液的pH，造成離子失衡[31-34]。

溫度是影響種子萌發(fā)的主要環(huán)境因子之一，可通過改變萌發(fā)種子內(nèi)水解酶活性、膜結(jié)合蛋白的活力及物質(zhì)代謝進(jìn)程等途徑影響種子萌發(fā)進(jìn)程[35]，在一定溫度范圍內(nèi)種子的萌發(fā)進(jìn)程隨著溫度的升高而加快，溫度過高或過低會延緩種子萌發(fā)進(jìn)程[11-12]。本研究中，溫度顯著影響丹參種子萌發(fā)進(jìn)程，18 ℃/28 ℃變溫條件下的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、生長狀況顯著優(yōu)于28 ℃/38 ℃，與馬紅媛等[7]和武袆等[36]所得結(jié)論類似。原因可能是18 ℃/28 ℃變溫條件下，丹參種子和幼苗胞內(nèi)代謝酶活性更高，物質(zhì)吸收利用更快，具體機(jī)理有待深入研究。

鹽溫互作對種子萌發(fā)的影響因不同植物而有所不同[37-39]，有研究表明小麥 (Triticum aestivum)種子發(fā)芽率受溫度與鹽的交互作用影響不顯著，而受溫度與堿的交互作用影響顯著[31]，紫花苜蓿在低溫低鹽脅迫時的種子萌發(fā)率高于其他鹽堿脅迫[40]。本研究表明鹽、堿和溫度的交互作用對丹參種子萌發(fā)和幼苗生長均存在顯著影響，18 ℃/28 ℃條件下丹參種子萌發(fā)和幼苗生長優(yōu)于28 ℃/38 ℃，不同濃度鹽堿脅迫均表現(xiàn)出相同規(guī)律，表明丹參種子發(fā)芽率對鹽堿脅迫的響應(yīng)受溫度的影響較大，即高溫對丹參種子發(fā)芽率的抑制作用更大。

綜上所述，鹽堿、溫度及其交互作用明顯影響丹參種子萌發(fā)和幼苗生長，低溫條件下鹽堿脅迫對丹參種子的影響相對較小；丹參種子萌發(fā)和幼苗生長對堿脅迫更為敏感。丹參耐鹽堿能力較弱，在鹽堿育苗時應(yīng)選擇鹽堿度較低的土地，適宜在溫度較低時進(jìn)行育苗，以提高其發(fā)芽率，保證丹參育苗成活率。