劉雪瓊，祝淡抹，楊 燕，劉雅雯，盧 丹**

[1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，揚(yáng)州 225001；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)，揚(yáng)州 225001；3.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225001；4.大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，大連 116044]

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特有的多器官、多系統(tǒng)損傷綜合征。PE不僅是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒發(fā)生胎盤早剝、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等疾病的主要原因[1]，也是母體晚年心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要危險(xiǎn)因素[2]，影響全球約5%～8%的妊娠[1]。雖然PE是由多種因素引起的，但胎盤因素是PE發(fā)生的先決條件，其中胎盤炎癥反應(yīng)失調(diào)在PE的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[3]。NLRP3炎性小體是介導(dǎo)先天免疫炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等多種疾病中炎性反應(yīng)的調(diào)控[4]。已有研究表明，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的NLRP3炎性小體可以被內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào),如尿酸、三磷酸腺苷、活性氧等激活，促進(jìn)IL-1β、IL-18的成熟和分泌，參與PE的發(fā)生與發(fā)展[5-6]。目前PE除了娩出胎盤，尚無有效治療方法，所以尋找有效治療PE胎盤炎癥的方法迫在眉睫。microRNA-223-3p (miR-223-3p)是粒細(xì)胞分化和激活的重要調(diào)節(jié)因子[7]，可通過靶向NLRP3抑制多種炎癥性疾病中的炎性反應(yīng)，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病[8-9]。然而，其在PE中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-223-3p能否通過靶向NLRP3抑制PE胎盤中的炎性反應(yīng)，以期為PE的治療找到一個(gè)新的潛在治療策略。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年12月至2020年1月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院住院分娩的60例孕婦，其中PE組30例(n=30)，正常對(duì)照組30例(n=30)。PE診斷標(biāo)準(zhǔn):妊娠20周后，新出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg，伴有尿蛋白≥0.3g/24h，或隨機(jī)尿蛋白≥(+)，或雖無尿蛋白，但合并下列任何一項(xiàng)者:血小板減少、肝功能損害、腎功能損害、肺水腫或新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異?；蛞曈X障礙。納入標(biāo)準(zhǔn):單胎妊娠，硬膜外麻醉剖宮產(chǎn)分娩，既往均無急慢性病史，無高血壓、糖尿病、心臟病、內(nèi)分泌代謝性疾病及肝腎病史，無風(fēng)濕、類風(fēng)濕、紅斑狼瘡等自身免疫相關(guān)疾病，無感染、炎癥，除外妊娠不良結(jié)局(胎兒生長(zhǎng)受限，早產(chǎn))無其他妊娠合并癥，無煙酒等不良嗜好。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有來自患者的組織樣本和數(shù)據(jù)信息在參與本研究前均獲得了參與者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 胎盤娩出后5min內(nèi)，無菌條件下取胎盤母體面中央近臍帶處約1cm×1cm×1cm大小組織3份，同時(shí)避開梗死、鈣化及出血等非正常區(qū)域。無菌生理鹽水漂洗3次，其中兩份分別放入裝有RNA保護(hù)液和福爾馬林固定液的容器中，4℃保存，另一份放入無菌凍存管，液氮保存，直至下一步使用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 HEK-293T細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)非編碼RNA轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室郁多男教授饋贈(zèng)。HTR8/SVneo細(xì)胞來源于ATCC傳代細(xì)胞，購自上海明州公司。在37℃、5%CO2、20%O2培養(yǎng)箱中，兩種細(xì)胞系分別在含10%胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HTR8/SVneo細(xì)胞，按4×105細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱孵育24h后，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度為70%左右時(shí)，給予不同濃度LPS(0、50、100、200、500、1000ng/mL)處理細(xì)胞24h，誘導(dǎo)HTR8/SVneo細(xì)胞炎癥模型。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3～8代，融合度為80%～90%)的HEK-293T細(xì)胞，0.25%胰酶消化收集并計(jì)數(shù)，按2×105細(xì)胞/孔接種到24孔培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱孵育過夜。待細(xì)胞融合度為60%～70%且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，利用Lipofectamine 2000(Lipo 2000)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按轉(zhuǎn)染說明書，提前1h將培養(yǎng)板中舊培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，按每孔1μg質(zhì)粒+2μL Lipo 2000的比例，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加至培養(yǎng)板孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后更換為完全培養(yǎng)基，48h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將HTR8/SVneo細(xì)胞按4×105細(xì)胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板，按每孔2.5μg miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒(或miR-223-3p陰性對(duì)照質(zhì)粒)+5μL Lipo 2000的比例，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加至培養(yǎng)板孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后，加LPS(500ng/mL)處理24h，收集細(xì)胞和上清，提取RNA和蛋白供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) 使用Trizol試劑從胎盤組織(100mg/樣本)或細(xì)胞中提取總RNA。選取A260/A280比值為1.8～2.0，且RNA完整度好的樣品，分別使用PrimeScriptTMRT Master Mix和Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒(Takara)，將0.5μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBR Green Mastermix試劑盒(Takara)操作說明將反應(yīng)液混勻，在生物實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。U6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部參照。反應(yīng)條件為初始變性:95℃ 30s，PCR反應(yīng):95℃ 5s，60℃ 60s，95℃ 10s，40個(gè)循環(huán)。引物序列由GenScript生物技術(shù)有限公司(江蘇，南京)設(shè)計(jì)并合成，見表1。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行熔解曲線分析，利用2-△△ct方法計(jì)算miR-223-3p和NLRP3相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的倍數(shù)變化，公式如下:ΔΔCt =ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct(目標(biāo)基因)- Ct(內(nèi)部參照)。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印跡分析(Western blot) 使用RIPA裂解液(Beyotime)(加PMSF蛋白酶、磷酸酶抑制劑)從胎盤組織和HTR-8/SVneo細(xì)胞中提取總蛋白，BCA檢測(cè)試劑盒(Beyotime)測(cè)量蛋白濃度。將每孔30μg蛋白質(zhì)樣品加至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)槽孔內(nèi)，進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。在200mA 90min條件下，將其濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1h，4℃冰箱過夜孵育一抗NLRP3(1∶1000，ab214185，Abcam)、caspase-1(1∶500，ab62698，Abcam)、GSDMD(1∶500，sc-81868，Santa Cruz)、β-actin(1∶1000，AF0003，Beyotime)。第二天，使用TBST洗膜3次，于室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1000，A0208/A0216，Beyotime)1h。最后在ECL發(fā)光液的作用下，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)免疫反應(yīng)信號(hào)，采用image-pro-plus 6.0軟件分析灰度值，計(jì)算相對(duì)蛋白水平。

1.2.6 免疫組織化學(xué)(IHC) 將胎盤組織包埋成蠟塊，切成4μm厚切片，置于載玻片，65℃連續(xù)烘烤4h，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇和蒸餾水脫水。將載玻片放入盛有0.01mol/L檸檬酸鹽修復(fù)液(pH=6.0)的高壓鍋中進(jìn)行水浴修復(fù)。按UItraSensitiveTMSP(小鼠/兔)免疫組化試劑盒(Kit-9720，MXB)說明書操作，其中孵育一抗NLRP3兔多克隆抗體的稀釋比為1∶200。在組織上滴加二氨基聯(lián)苯胺DAB染液顯色，在顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，適時(shí)終止反應(yīng)。將載玻片用蘇木精核復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理。最后用中性膠封膜，顯微鏡下讀片。棕黃色顆粒沉淀為陽性蛋白表達(dá)區(qū)域。采用image-pro-plus 6.0軟件分析每張圖片的顯色面積和光密度值，對(duì)陽性蛋白染色區(qū)域進(jìn)行定量分析。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan(http://www.targetscan.org/)、miRWalk (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)和miRBase(http://www.mirbase.org/index.shtml)預(yù)測(cè)miR-223-3p和NLRP3 3'-非翻譯區(qū)(3'UTR)的潛在結(jié)合位點(diǎn)序列。合成NLRP3 3'UTR野生型(wt)和突變型(mut)結(jié)合位點(diǎn)基因片段，分別將其亞克隆到GV272堿性質(zhì)粒載體，生成NLRP3-3'UTR-wt和NLRP3-3'UTR-mut熒光素酶載體。利用Lipo 2000將0.5μg螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、0.4μg miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒(或miR-223-3p陰性對(duì)照質(zhì)粒)和0.1μg海腎熒光素酶質(zhì)粒(內(nèi)參)共同轉(zhuǎn)染到生存狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞。按雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)說明書操作，并檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果用螢火蟲和海腎熒光素酶的相對(duì)光單位比值表示。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 用無菌試管收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，3000r/min離心20min，用ELISA試劑盒(JYM0083Hu，JYM0092Hu，武漢)檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-18的分泌水平。測(cè)定各孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程，線性回歸與期望濃度的相關(guān)系數(shù)r值均在0.99以上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子IL-1β、IL-18的濃度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群的特征 PE孕婦和正常妊娠孕婦的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PE孕婦的收縮壓、舒張壓、24h蛋白尿、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)和尿酸均明顯高于正常孕婦，而分娩孕周及新生兒出生體重明顯低于正常孕婦，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 NLRP3在胎盤組織中的表達(dá)模式 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常妊娠組相比，PE患者胎盤中NLRP3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PE患者胎盤組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。IHC結(jié)果顯示，NLRP3陽性蛋白主要表達(dá)于胎盤的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，呈淡黃色、棕色或棕褐色外觀，且PE患者胎盤組織中NLRP3陽性蛋白表達(dá)水平明顯高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。

表2 研究人群的臨床特征

圖1 NLRP3在胎盤組織中的表達(dá)模式

2.3 NLRP3與miR-223-3p的靶向關(guān)系及miR-223-3p在胎盤中的表達(dá)模式 生物信息學(xué)網(wǎng)站獲得miR-223-3p與NLRP3 3'UTR的特異性結(jié)合位點(diǎn)序列(圖2A)。經(jīng)典的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒到HEK-293T細(xì)胞中，能與細(xì)胞中NLRP3-3'UTR-wt質(zhì)粒特異性結(jié)合，顯著降低細(xì)胞的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒不能與NLRP3-3'UTR-mut相互作用，細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(圖2B)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PE胎盤組織中miR-223-3p表達(dá)水平較正常組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2C)。

2.4 脂多糖(LPS)刺激HTR8/SVneo細(xì)胞構(gòu)建PE胎盤炎癥模型 不同濃度LPS(0、50、100、200、500、1000ng/mL)體外刺激HTR8/SVneo細(xì)胞24h后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組(LPS為0ng/mL)相比，隨著LPS濃度增加，HTR8/SVneo細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)水平均逐漸提高。當(dāng)LPS為500ng/mL時(shí)，上述基因mRNA的表達(dá)水平升高最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3A)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平隨著LPS濃度的增加明顯升高，且LPS為500ng/mL時(shí)，升高最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HTR8/SVneo細(xì)胞中IL-1β和IL-18分泌水平逐漸增加，呈LPS濃度依賴型，同樣當(dāng)LPS為500ng/mL時(shí)最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3C)。

圖2 NLRP3與miR-223-3p的靶向關(guān)系及miR-223-3p在胎盤中的表達(dá)模式

圖3 不同濃度LPS體外刺激HTR8/SVneo細(xì)胞24h,NLRP3炎性小體相關(guān)基因及下游炎性因子的表達(dá)變化情況

2.5 PE炎癥模型中miR-223-3p過表達(dá)對(duì)NLRP3的調(diào)控作用 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Blank組(未做任何處理的HTR8/SVneo細(xì)胞)相比，LPS誘導(dǎo)可降低HTR8/SVneo細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒后，可顯著提高HTR8/SVneo細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖4A)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)HTR8/SVneo細(xì)胞高表達(dá)NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒后，可明顯降低上述基因mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4B)。Western blot結(jié)果顯示，LPS可明顯提高NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)?？娠@著抑制上述蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)可顯著提高HTR8/SVneo細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18濃度(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-223-3p過表達(dá)質(zhì)粒可顯著降低上述炎性因子的濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4D)。

圖4 miR-223-3p過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體相關(guān)基因及下游炎性因子的調(diào)控作用

3 討 論

妊娠本身是一個(gè)輕度炎癥反應(yīng)的過程，但是母胎界面的炎癥免疫失調(diào)會(huì)引起炎癥因子的不平衡分泌，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，引起PE的發(fā)生[10]。在炎癥初期進(jìn)行積極主動(dòng)的藥物干預(yù)可預(yù)防過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而阻止PE及其并發(fā)癥的發(fā)生。目前針對(duì)PE尚無理想的治療措施，因此尋找有效的抗炎抑制劑成為治療PE的熱點(diǎn)問題。

NLRP3炎性小體是由核心蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和前半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(pro-caspase-1)組成的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多蛋白復(fù)合物，參與多種炎性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制[4]。本文通過多種實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)，核心蛋白NLRP3在PE胎盤中高表達(dá)，且主要表達(dá)于胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，這與Weel等[11]先前描述性的研究結(jié)果一致。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中NLRP3炎性小體過度激活，不僅可提高胎盤中炎性因子IL-1β的分泌水平，引發(fā)母胎界面一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]，還可通過活化的caspase-1溶解細(xì)胞上的GSDMD蛋白介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生裂解死亡，即滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡[13]。后者一方面阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、分化、發(fā)育，使得胎盤淺著床，血管重鑄障礙；另一方面釋放炎癥因子入血，聚集其他免疫細(xì)胞，造成炎癥反應(yīng)過度激活和母體血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損傷，進(jìn)而導(dǎo)致PE的發(fā)生。此外，Xu等[14]報(bào)道特異性NLRP3基因多態(tài)性與PE風(fēng)險(xiǎn)顯著增加密切相關(guān)。由此可見，母胎界面NLRP3的過度激活在PE的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。大量體外和動(dòng)物研究表明，NLRP3抑制劑可有效抑制炎癥反應(yīng)。但目前尚沒有針對(duì)PE的特異性治療藥物，因此尋找有效的NLRP3抑制劑可能成為治療PE的潛在靶點(diǎn)。

miR-223是一種與炎癥和感染密切相關(guān)的microRNA[15]，由miR-223-3p和miR-223-5p組成，其中只有前體miR-223的3臂端被認(rèn)為是成熟和有功能的[16]。大量研究表明，miR-223是NLRP3的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，可通過特異性靶向NLRP3的3'UTR來降低多種疾病中的炎癥反應(yīng)。如miR-223在小鼠中性粒細(xì)胞中過表達(dá)可降低NLRP3炎性小體的活性，從而導(dǎo)致IL-1β的分泌減少[17]；在腦出血后，miR-223可下調(diào)NLRP3以抑制炎癥反應(yīng)，減少腦水腫，改善神經(jīng)功能[18]。有趣的是，microRNAs在新的一項(xiàng)研究中被表明可作為口服藥物，在動(dòng)物胃黏膜中直接被吸收利用，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。如Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，吸收植物MIR2911金銀花湯可抑制SARS-CoV-2的復(fù)制，加速感染患者的負(fù)轉(zhuǎn)化。因此，本研究的目的是探討miR-223-3p能否作為PE炎癥的抗炎保護(hù)劑，通過靶向NLRP3抑制PE的炎癥反應(yīng)。

本研究通過經(jīng)典的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，NLRP3是miR-223-3p的一個(gè)直接靶基因。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-223-3p在胎盤中表達(dá)豐富，但是與正常妊娠組相比，miR-223-3p在PE組中顯著低表達(dá)。LPS是一種革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素，其脂質(zhì)可誘導(dǎo)NLRP3炎性體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[20]。超低劑量的LPS可誘導(dǎo)妊娠大鼠特異性持續(xù)炎癥狀態(tài)和PE樣臨床癥狀，如高血壓、蛋白尿、血小板減少等[21]。本研究通過LPS刺激人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞，建立PE炎性細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，500ng/mL的LPS誘導(dǎo)24h后，可顯著提高HTR8/SVneo細(xì)胞中炎性小體組分NLRP3、caspase-1和焦亡相關(guān)蛋白GSDMD的表達(dá)，以及下游炎性因子IL-1β和IL-18的分泌。而當(dāng)炎癥模型細(xì)胞中過表達(dá)miR-223-3p后，上述一系列基因的表達(dá)水平被明顯抑制，表明miR-223-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的HTR8/SVneo細(xì)胞中NLRP3炎性小體的激活、細(xì)胞焦亡和炎性因子的分泌有一定的抑制作用。

綜上所述，miR-223-3p可能通過靶向NLRP3抑制PE胎盤中的炎性反應(yīng)和滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡，提示miR-223-3p可能是PE胎盤炎癥的潛在治療靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H限于NLRP3和miR-223-3p在胎盤中表達(dá)的描述性研究，在體外也只是初步探討了miR-223-3p過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型中NLRP3炎性小體相關(guān)基因的部分調(diào)控機(jī)制，對(duì)于miR-223-3p與NLRP3炎性小體組配之間內(nèi)在的緊密聯(lián)系尚不清楚，這需要在將來的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行更加深入的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。此外，一個(gè)miRNA可同時(shí)靶向調(diào)控多個(gè)靶基因[22]，因此miRNA治療存在傳遞準(zhǔn)確性和效率的挑戰(zhàn)，這也是未來實(shí)驗(yàn)中需解決的難題。