肖曉蓮，劉曉燕，朱文鳳，楊曄宏，楊俊濤，孫 偉*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.藥理系；2.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

代謝組學(xué)(metabolomics)分析方法是研究小分子代謝物的有效工具，能夠直接反映生命體終端和表型信息，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用[1-4]?；谫|(zhì)譜(mass spectrum,MS)的非靶向代謝組學(xué)分析方法已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括疾病生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、代謝通路研究和尋找調(diào)節(jié)某些疾病表型的生物活性化學(xué)物質(zhì)，比如脫髓鞘病, 糖尿病或腫瘤等[5-8]。

非靶向代謝組學(xué)分析方法中常用的數(shù)據(jù)采集模式有兩種，即全掃描采集(full scan acquisition, FSA)模式和數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent acquisition, DDA)模式。FSA模式對每個樣本進行一級質(zhì)譜圖(MS)掃描以獲得所有代謝特征的精確質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio, m/z)和相對豐度，再選擇靶向的離子掃描二級質(zhì)譜(MS/MS,MS2)圖進行代謝物的鑒定。DDA模式是在進行一級質(zhì)譜圖掃描的同時，選擇一級譜圖中的高豐度離子進行二級譜圖采集，一次實驗同時完成代謝物的定性和定量分析。以往文獻表明，不同數(shù)據(jù)采集模式會影響代謝物的鑒定和定量[9]。目前，對非靶向代謝組學(xué)分析方法的采集模式比較的研究仍很缺乏且不全面。有人使用代謝物標(biāo)準(zhǔn)品分析比較兩種模式鑒定的代謝物數(shù)目，但未進行定量比較；同時，該研究缺乏真實生物樣本的代謝物的定性定量比較，并且未考慮不同豐度及峰寬的代謝物的定性定量結(jié)果[10]。本研究擬分別用代謝物標(biāo)準(zhǔn)品混合物和健康人尿液代謝物進行兩種采集模式的質(zhì)譜分析，以從代謝物的定性及定量兩個方面，全面地比較了兩種數(shù)據(jù)采集模式進行質(zhì)譜分析的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：乙腈、甲酸(Merk公司)；水(質(zhì)譜級)、標(biāo)準(zhǔn)品：醋氨酚、咖啡因、磺胺脒、磺胺二價氧嘧啶、纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸、維拉帕米、特非那定、亮氨酸腦啡肽和利血平9種代謝物(Waters公司)；尿液：10名健康人的晨尿(晨起第一次尿液)，每人留取50 mL，4 500×g離心10 min去細胞碎片。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜分析分別采用FSA和DDA兩種模式采集，進樣2 μL，分別進行3次實驗操作重復(fù)。

1.2.2 尿液代謝物的提?。好總€尿液樣本取200 μL，加入等量乙腈混合，放置-20℃冰箱30 min后，14 000×g離心10 min，取上清吹干后加入200 μL 2%乙腈溶解。

提取尿液代謝物后，每個樣本取3 μL代謝物提取液混合成一份混合物上機。質(zhì)譜分析分別采用FSA和DDA兩種模式采集(FSA組和DDA組)，設(shè)置3個進樣量，包括1、2和4 μL，每個進樣量進行3次實驗操作重復(fù)。

1.2.3 質(zhì)譜分析代謝物：標(biāo)準(zhǔn)品混合物和尿液代謝物經(jīng)色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)進行分離，多肽的洗脫液梯度為2%～100% B液(0.1%甲酸，100%乙腈)，流速為500 μL/min，洗脫時間為17 min。洗脫的代謝物用Triple TOF5600質(zhì)譜儀分析(AB Sciex, 多倫多, 安大略省, 加拿大)，分析模式分別采用FSA模式和DDA模式。FSA模式參數(shù)如下：一級全掃描范圍為50～1 200 m/z，累積時間為0.25 s, GAS1為55 psi，GAS2為55 psi，Curtain Gas為35 psi，溫度為550 ℃，電離噴霧電壓為4 500 V；二級定性掃描碰撞能量使用20、35、50、35步長15 eV，每個循環(huán)選豐度top4一級質(zhì)譜(LC-MS)圖進行二級質(zhì)譜(LC-MS/MS)采集，動態(tài)排除時間為5 s，選擇動態(tài)背景排除。DDA模式參數(shù)如下：一級全掃描范圍為50～1 200 m/z，一級累積時間為0.25 s，二級累積時間為0.1 s，GAS1為55 psi，GAS2為55 psi，Curtain Gas為35 psi，溫度為550 ℃，電離噴霧電壓為4 500 V，二級定性掃描碰撞能量為35步長15 eV，每個循環(huán)選豐度top4一級質(zhì)譜圖進行二級質(zhì)譜采集，動態(tài)排除時間為5 s，選擇動態(tài)背景排除。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果的分析

FSA組的9個代謝物豐度均高于DDA組(P<0.05)(圖1A)。其中，亮氨酸腦啡肽差異最明顯，在FSA組的豐度(abundance)比DDA組高約3倍。全部代謝物在FAS組的豐度比DDA組平均高約2.36倍(圖1)。

A.abundance of known metabolite; B.coefficient of technical variation；*P<0.05 compared with full scan acquisition圖1 代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的定量分析Fig 1 Quantitative analysis of known

有8個代謝物豐度的變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)值在DDA組明顯高于FSA組，維拉帕米的豐度CV值在兩組中相近。DDA組的CV值范圍在2.14%至11.20%，F(xiàn)SA組的CV值范圍在0.81%至6.35%(圖1B)。

2.2 尿液樣本的分析

2.2.1 定性比較:進樣量為1、2和4 μL時，F(xiàn)SA組的一級譜圖數(shù)、二級譜圖數(shù)、代謝特征數(shù)目及二級譜圖匹配的代謝特征數(shù)均稍多于DDA組(表1)。

表1 兩種數(shù)據(jù)采集方法的液相二級質(zhì)譜(MS2)結(jié)果Table 1 LC-MS/MS(MS2) data of the two acquisition

進樣量為1 μL時，F(xiàn)SA組鑒定的代謝物較DDA組多9.5%。進樣量為2 μL時，兩組鑒定的代謝物數(shù)目相近。進樣量為4 μL時，F(xiàn)SA組鑒定的代謝物數(shù)目較DDA組多10%(圖2)。

*P<0.05 compared with full scan acquisition圖2 兩種采集方法尿液代謝物鑒定結(jié)果比較Fig 2 Comparison of urine metabolite number in two acquisition methods

2.2.2 定量比較:進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV中位數(shù)為10.3%、7.0%和6.5%，F(xiàn)SA組的CV中位數(shù)為7.1%、3.0%和2.6%。3種進樣量中，兩組的豐度CV分布趨勢一致，DDA組的CV分布總體高于FSA組(圖3)。

A.technical CV distribution of urinary metabolites with 1 μL loading amount; B.technical CV distributionof urinary metabolites with 2 μL loading amount; C. technical CV distribution of urinary metabolites with 4 μL loading amount圖3 兩種采集方式不同上樣量尿液代謝物實驗操作CV重復(fù)性比較Fig 3 Distribution of repeatitive technical CV comparison of urinary metabolites in two acquisition methods

低豐度代謝物(質(zhì)譜信號強度10～100)中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組代謝物的豐度CV均數(shù)分別較FSA組高1.3、1.7和1.9倍(P<0.05)。中(信號強度100～1 000)、高(信號強度為>1 000)豐度代謝物中，進樣量為1 μL時，兩組的CV均數(shù)相近；進樣量為2和4 μL時，DDA組代謝物的豐度CV均數(shù)分別較FSA組高1.7、1.8和1.9、1.4倍(P<0.05)(圖4A)。

在峰寬時間<5 s的代謝物中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高1.8、1.7和2.2倍(P<0.05)。峰寬時間為5～10 s的代謝物中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高1.5、2.1和2.1倍(P<0.05)。峰寬時間為>10 s的代謝物中，進樣量為1 μL時，兩組的CV均數(shù)相近；進樣量為2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高2.0和2.0倍(P<0.05)(圖4B)。

A.technical CV distribution of metabolites with different abundance; B. technical CV distribution of metabolites with different chromatographic peak width; *P<0.05 compared with full scan acquisition圖4 兩種數(shù)據(jù)采集方式鑒定代謝物豐度和峰寬的實驗操作CV重復(fù)性分布比較Fig 4 Distribution of repeatitive technical CV comparison of metabolites with different abundance and chromatographic peak width in two acquisition

3 討論

本研究比較了FSA和DDA兩種質(zhì)譜采集方法在非靶向代謝組學(xué)分析方法中的結(jié)果。通過分析代謝物標(biāo)準(zhǔn)品混合樣和健康人尿液代謝物，結(jié)果表明，兩種模式都能對上述樣品進行定性定量分析，擁有各自的優(yōu)缺點。

FSA模式鑒定的代謝物數(shù)目更多，并且鑒定的代謝物豐度總體高于DDA模式，定量的重復(fù)性和準(zhǔn)確度更高。在FSA模式中，質(zhì)譜將全部的時間用于采集一級譜圖。因此，采集代謝物色譜峰的數(shù)據(jù)點數(shù)多，定量的準(zhǔn)確性更高；另一方面，因為有更多時間進行數(shù)據(jù)采集，可以采集到色譜峰的最高點，定量的色譜峰面積更大,因此強度更高。定性方面，F(xiàn)SA模式的二級鑒定使用了4種不同的碰撞能量，可以采集更多信息量,因此鑒定的代謝物多。以往文獻報道，在非靶向代謝組學(xué)中，F(xiàn)SA模式相比DDA模式可以捕獲更多代謝物特征，由于FSA模式采集一級譜圖的時間更多，這與本研究結(jié)果一致[10]。 但是，F(xiàn)SA模式仍存在不可忽略的問題，該模式下代謝物的定量與定性分析是分開檢測的，需要進行兩批次的質(zhì)譜分析，這對液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求高。只有色譜的保留時間在一致的情況下，才能確保兩次采集的數(shù)據(jù)具有可分析性。尤其是，對大批量樣品進行長時間分析時，技術(shù)難度相對較大。因此，該方法更適用于小規(guī)模樣品量的代謝組分析。

DDA模式可同時進行一級和二級譜圖的采集，定性與定量僅需采集一次即可實現(xiàn)。但是，由于DDA模式的一級譜圖采集分配了很大一部分采集時間用于二級譜圖的產(chǎn)生，導(dǎo)致錯過色譜峰的最高點，定量的峰面積較低，峰強度較低；而且，采集色譜峰的點數(shù)減少，導(dǎo)致定量的準(zhǔn)確性降低。而定性方面，由于DDA模式的二級碰撞能量只有一種，采集的信息量較少。因此，鑒定的代謝物數(shù)目相對少。雖然DDA模式有以上問題，但DDA模式定量的CV在10%左右，尚在誤差允許范圍內(nèi)，定性數(shù)目也僅少10%?？紤]到DDA模式對系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求相對較低，并且操作簡便，省時省樣本量，因此，其更適用于長時間大樣品量分析。

本研究全面分析了尿液代謝組學(xué)非靶向質(zhì)譜分析法常用的兩種數(shù)據(jù)采集模式，評價其各自的優(yōu)缺點，為非靶向分析方法的選擇提供了參考。