周佳鋒，馬孟杰，彭小忠,2*，舒鵬程*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室 醫(yī)學(xué)靈長類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

大腦皮質(zhì)作為神經(jīng)系統(tǒng)的最高級部分，在意識、運動調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮重要功能，而神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells, NPCs)在大腦皮質(zhì)的發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。發(fā)育早期神經(jīng)祖細(xì)胞不對稱分裂產(chǎn)生神經(jīng)元，而在晚期部分細(xì)胞能繼續(xù)產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞[1]。因此研究神經(jīng)祖細(xì)胞能夠加深人們對大腦皮質(zhì)的了解。

特異的標(biāo)記以及分選神經(jīng)祖細(xì)胞是研究祖細(xì)胞必不可少的實驗。目前常用的標(biāo)記方法包括5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)標(biāo)記、病毒標(biāo)記以及子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)(in utero electroporation)標(biāo)記[2-6]。羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)可透膜，在胞內(nèi)被水解為乙酸基團(tuán)，水解后的CFSE無法透膜，結(jié)合胞內(nèi)蛋白從而穩(wěn)定標(biāo)記細(xì)胞[7]。將CFSE注射到側(cè)腦室，所有與腦脊液直接接觸的細(xì)胞都將被標(biāo)記，包括處于M期的神經(jīng)祖細(xì)胞[8]。Denis Jabaudon等人開發(fā)的FlashTag技術(shù)就用到了上述的原理[7]。然而若要做到上述的特異標(biāo)記神經(jīng)祖細(xì)胞，必然要求染料能夠較好地局限在腦室區(qū)，而非向上擴(kuò)散到皮質(zhì)板區(qū)。本研究探索了CFSE標(biāo)記神經(jīng)祖細(xì)胞的方法并進(jìn)行了體內(nèi)、體外驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：本研究用到的所有小鼠均為SPF級CD-1孕鼠，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，12周齡，懷孕天數(shù)為14.5 d，體質(zhì)量在50 g左右。完成實驗后的小鼠通過頸椎脫臼法處死。本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院實驗動物中心的實驗動物倫理審查(倫理編號ACUC-A01-2021-009)。

1.1.2 主要試劑：CFSE(Thermo Fisher Scientific公司)，D-PBS(Gibco公司)。使用抗體如下：兔抗FITC(ab19224, 1∶500稀釋)、兔抗Tbr2(ab23345, 1∶500稀釋)、兔抗NeuroD2(ab104430, 1∶500稀釋)(Abcam公司)；兔抗Sox2(Sigma-Aldrich AB5603, 1∶500稀釋)、兔抗Cux1(sc13024, 1∶500釋)、鼠抗Tle4(sc365406, 1∶500稀釋)(Santa Cruz公司); 抗兔647熒光二抗(A-31573, 1∶1 000稀釋)、抗鼠647熒光二抗(A-31571, 1∶1 000稀釋)(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮內(nèi)注射:參考以往的鼠胚電轉(zhuǎn)實驗以及“FlashTag”方法[7,9]，將孕鼠麻醉后，小心分離出胎鼠，利用玻璃毛細(xì)管針，在E13.5和E14.5分別將混有快綠(Fast Green)的CFSE注射到側(cè)腦室，注射量為0.2 μL，隨后將胚胎放回腹腔，縫合。

1.2.2 免疫熒光實驗:收集的組織固定包埋于-80 ℃。組織冰凍切片厚度為16 μm。綿羊血清封閉后孵育一抗，4 ℃過夜。二抗用對應(yīng)源的熒光二抗，稀釋比例為1∶1 000。

將流式分選得到的細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞固定到爬片上后再進(jìn)行免疫熒光步驟，操作與上述類似。

1.2.3 神經(jīng)祖細(xì)胞分選:CFSE注射到側(cè)腦室后1 h，頸椎脫臼法處死孕鼠，收集胎鼠，用鑷子分離大腦皮質(zhì)兩側(cè)半球的背側(cè)，隨后使用剪刀破碎組織，用accutase 酶于37 ℃消化30 min左右，期間每5 min用1 mL移液器吹打20次[10]，獲得的細(xì)胞懸液過篩成單細(xì)胞懸液，離心后用300 μL 0.5% BSA D-PBS(Dulbecco’s phosphate buffer saline)重懸。細(xì)胞懸液在上機(jī)前用200 μL移液器重懸，采用Sony SH800全自動流式分選儀，分選出熒光強度前10%的細(xì)胞[7]，記為強陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 CFSE能夠快速標(biāo)記VZ區(qū)細(xì)胞

在CFSE被注射到側(cè)腦室后1、3和6 h時收取胚胎，檢測信號(圖1A)。可以看到CFSE信號均勻的分布在室周區(qū)ventricular zone (VZ)區(qū)域，包括背側(cè)和腹側(cè)，同時還延伸至第三腦室(圖1B)。注射后1 h，可以在VZ區(qū)觀察到較強的CFSE信號，同時，所有有絲分裂標(biāo)志物(PH3)陽性的細(xì)胞均被CFSE標(biāo)記(圖1C)。注射后3 h，CFSE依然能夠標(biāo)記VZ區(qū)細(xì)胞，但是有少量PH3陽性細(xì)胞并未被標(biāo)記(圖1C′，白色箭頭)。注射后6 h，CFSE信號在最低端區(qū)域已無法檢測到，同時被標(biāo)記的細(xì)胞也已向上遷移離開該區(qū)域(圖1C″)。

A.A graphic diagram of the injection of CFSE and the detection strategy; B.an overall view of the distribution of CFSE at 1 hour post-injection; C-C″.co-labelling with mitotic marker PH3 at 1, 3 and 6 hours post-injection, respectively; scale bar=100 μm圖1 CFSE的分布高度局限于VZ區(qū)Fig 1 CFSE showed a highly restricted distribution within the VZ(n=3)

2.2 CFSE長時程標(biāo)記具有一定的穩(wěn)定性

在胚胎期第14.5天(embryonic day 14.5, E14.5)進(jìn)行CFSE標(biāo)記，出生后第1天(postnatal day1, P1)收取組織檢測(圖2A, A′,D,D′)，通過免疫熒光對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，顯示CFSE信號集中在Tle4的上方，即皮質(zhì)上層區(qū)域(圖2C)。CFSE的信號強度存在較大的差異，部分細(xì)胞的信號非常微弱，用FITC抗體可以放大信號(圖2B,B′，白色箭頭)。到P3時，CFSE信號集中在上層，在Cux1陽性區(qū)域形成一個較薄的亞層(圖2F)。類似地，通過FITC抗體增強信號，可以發(fā)現(xiàn)有較多的細(xì)胞CFSE信號發(fā)生了衰減(圖2E,E′,白色箭頭)。

A-A′, D-D′.an overall view of the distribution of CFSE signal; B-B′, E-E′.detection with anti-FITC to enhance the signal; C, F.co-labelling with Tle4 and Cux1, respectively; scale bar=500 μm for A-A′ and D-D′;scale bar=200 μm for the rest圖2 CFSE信號在長時程標(biāo)記中有衰減Fig 2 CFSE signal decayed in long-term labelling(n=3)

2.3 CFSE可用于分選神經(jīng)祖細(xì)胞

CFSE注射1 h后收取腦組織，分離背側(cè)皮質(zhì)，F(xiàn)ACS分選熒光強度前10%的細(xì)胞(圖3A)，記為強陽性細(xì)胞。分選后的細(xì)胞通過Sox2、NeuroD2和Tbr2免疫熒光檢測以確定其身份(圖3B-B″, C-C″, D-D″)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Sox2陽性細(xì)胞占所有強陽性細(xì)胞的70%，Tbr2陽性細(xì)胞占13%，而NeuroD2陽性細(xì)胞占37%。

A.FACS sorting of top 10% positive cells; B-B″, C′-C″ and D-D″.co-labelling with Sox2, NeuroD2 and Tbr2 to identify sorted cells; E.a bar chart of the ratio of marker-positive cells to total FT-positive cells;S for Sox2, T for Tbr2, N for NeuroD2 and F for CFSE圖3 CFSE可用于分選神經(jīng)祖細(xì)胞Fig 3 CFSE was suitable for sorting of neural progenitor cells (scale bar=100 μm, n=3)

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞的在體標(biāo)記和示蹤是揭示神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的重要手段，目前常用的標(biāo)記方法有BrdU標(biāo)記、電轉(zhuǎn)標(biāo)記以及FlashTag等[2,7]。原理上，BrdU是一種核苷酸類似物，在S期DNA復(fù)制時摻入進(jìn)而標(biāo)記細(xì)胞。子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)通過電場作用將表達(dá)熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，主要標(biāo)記S期和M期的細(xì)胞。FlashTag則是利用了某些脂溶性染料進(jìn)入細(xì)胞后被分解為水溶性物質(zhì)進(jìn)而被鎖定在細(xì)胞內(nèi)的特點，將染料注射到腦室后標(biāo)記VZ區(qū)M期細(xì)胞。

上述標(biāo)記原理決定了它們的檢測時間和標(biāo)記時長上存在差異。BrdU可以快速摻入正在復(fù)制的DNA中。因此，在注射后30 min即可被檢測到。CFSE在注射后也可以快速進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，據(jù)報道在注射后的20 min即可檢測到信號。而電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒表達(dá)蛋白需要10 h甚至更久[7]。在標(biāo)記時長方面，三者也存在差異，通常認(rèn)為BrdU的標(biāo)記時長在2～6 h，6 h后體內(nèi)的BrdU濃度已無法再標(biāo)記細(xì)胞。以往的文獻(xiàn)報道CFSE的標(biāo)記時長在2～3 h[7]，而本研究的結(jié)果與以往的報道有一定的差異。在本研究中，CFSE注射后3 h，VZ區(qū)依然有較多的CFSE殘留，能夠繼續(xù)標(biāo)記細(xì)胞，而到注射后6 h，VZ區(qū)已幾乎沒有CFSE信號，因此推測CFSE的標(biāo)記時長在3～6 h。與上述兩種方法相比，電轉(zhuǎn)質(zhì)粒是依賴電場的瞬間標(biāo)記，電場作用消失后也就無法再標(biāo)記細(xì)胞。

CFSE標(biāo)記神經(jīng)祖細(xì)胞后可進(jìn)一步被用于細(xì)胞分選。本實驗分選了CFSE熒光強度前10%的細(xì)胞。雖然這些強陽性細(xì)胞大部分是Sox2陽性的神經(jīng)祖細(xì)胞，但部分卻是NeuroD2陽性的細(xì)胞，而NeuroD2僅表達(dá)于有絲分裂后的神經(jīng)元(post-mitotic neurons)[11]。CFSE主要標(biāo)記VZ區(qū)底端的細(xì)胞，但CFSE也有可能向上滲透標(biāo)記遠(yuǎn)端的細(xì)胞，同時部分遠(yuǎn)端細(xì)胞的end-feet可能會吸收CFSE進(jìn)而也被標(biāo)記上[7]。另外，細(xì)胞被分選后還需在培養(yǎng)基中進(jìn)行長達(dá)10 h的細(xì)胞爬片，期間部分細(xì)胞可能發(fā)生分化，表達(dá)NeuroD2。綜上，雖然目前的分選策略已可以保證一定的純度，但或許設(shè)置更嚴(yán)格的分選策略能進(jìn)一步提高分選的純度。