李 辰，修建波，許 琪

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

抑郁癥(depressive disorder)是一種發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為情緒低落、興趣減退和愉悅感喪失等癥狀的精神疾病[1]。雖然近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)多種抑郁癥的治療手段，但傳統(tǒng)的抗抑郁藥對(duì)大多數(shù)患者不能起到很好的效果。PARP14是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-adenosine diphosphate-ribose polymerase, PARP)18個(gè)家族成員之一，它可以將ADP核糖從NAD+分子中裂解出并轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上，實(shí)現(xiàn)該蛋白的翻譯后單ADP核糖基化修飾。已有臨床研究提示一些原批準(zhǔn)用于惡性腫瘤治療的PARP家族抑制劑在抑郁癥治療中的潛力[2]，而PARP家族成員在抑郁癥中的表達(dá)量變化尚未見(jiàn)報(bào)道。

除了在DNA損傷修復(fù)、抑制癌中發(fā)揮作用外[3]，PARP14被發(fā)現(xiàn)是一類(lèi)參與炎性反應(yīng)調(diào)控的分子，如調(diào)控巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)、促進(jìn)B細(xì)胞生存等[4-5]。而神經(jīng)炎性反應(yīng)假說(shuō)長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是導(dǎo)致抑郁癥的主要機(jī)制之一，抑郁癥患者外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有較高水平的促炎細(xì)胞因子，例如白介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的固有先天免疫細(xì)胞，其功能異常與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[7]。本研究旨在探究PARP14與抑郁癥的相關(guān)性及其在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)過(guò)程中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：用于建模的8周雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(L8880, Solarbio公司)；PARP14抗體及siRNA(sc377150 & sc76057， Santa Cruz公司)；GeA-69(HY-108708, MCE公司)；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(04-001-1ACS, BI公司); DMEM、0.25%胰蛋白酶、青霉素鏈霉素(CC15019、CC017、CC004,邁晨公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000與Lipofectamine RNA iMAX(11668019 & 13778150, Thermo Fisher Scientific公司)；Trizol(15596018, Invitrogen公司)；cDNA合成試劑盒(04379012001, Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑郁癥動(dòng)物模型的建立：1)慢性束縛模型[chronic restraint(CRS) model]模型建立按照文獻(xiàn)[8]執(zhí)行，將18只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9只。將實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)21 d隨機(jī)時(shí)間放入塑料管中(每天4～6 h)進(jìn)行建模，對(duì)照組無(wú)處理，建模結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試及樣本收集；CRS建模同時(shí)，將18只小鼠隨機(jī)分為6組，每組3只，分別束縛0、1、3、5、7、14 d后取腦組織樣本。2)慢性不同預(yù)知壓力模型[chronic unpredictable mild stress(CUMS)model]使用實(shí)驗(yàn)室前期建模存留樣本[9]。3)LPS模型[lipopolysaccharide(LPS) model]建立按照先前文獻(xiàn)[10]執(zhí)行，將8只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組4只，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射LPS 1 mg/kg，對(duì)照組小鼠注射0.9%氯化鈉溶液，24 h后收集小鼠海馬組織。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)：強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swim test, FST)和糖水偏愛(ài)測(cè)試(sucrose preference test, SPT)被用于測(cè)試模型小鼠的抑郁樣行為。強(qiáng)迫游泳測(cè)試可以反映出小鼠行為上的絕望，測(cè)試時(shí)將小鼠放入透明的1 000 L燒杯中，用錄像設(shè)備記錄小鼠6 min內(nèi)的行為，計(jì)數(shù)后4 min小鼠的不動(dòng)時(shí)間；糖水偏愛(ài)測(cè)試前3 d小鼠進(jìn)行雙瓶飲水訓(xùn)練(一瓶正常飲水、一瓶1.5%蔗糖溶液)，測(cè)試前24 h禁水，測(cè)試時(shí)允許動(dòng)物自由攝取水或蔗糖溶液，2 h后記錄并計(jì)算小鼠的蔗糖偏愛(ài)度：蔗糖偏愛(ài)度(sucrose preferences，%)=蔗糖消耗量/總消耗量×100%。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：BV2細(xì)胞系以56 ℃預(yù)處理1 h、含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天傳代。BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭iRNA時(shí)接種至六孔板，培養(yǎng)18～24 h后按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PARP14質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒；敲低組轉(zhuǎn)染PARP14 si RNA，敲低對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照si RNA。分別于轉(zhuǎn)染后6、24 h換液，38～44 h后加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制劑組于細(xì)胞接種后40 h加入250 nmol/L PARP14抑制劑GeA-69，無(wú)抑制劑對(duì)照組加入DMSO，處理2 h后再加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 RNA提取與基因表達(dá)量檢測(cè)：取新鮮海馬組織液氮速凍后保存于-80 ℃直至使用。RNA提取使用Trizol勻漿和氯仿層分離法分離RNA。用轉(zhuǎn)錄本cDNA合成試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行后續(xù)RT-qPCR檢測(cè)。檢測(cè)引物見(jiàn)表1，結(jié)果以2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

表1 RT-qPCR檢測(cè)引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism6.0和SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)使用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析；多組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，組間值使用q分析；使用Person相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 抑郁癥模型小鼠海馬區(qū)PARP14表達(dá)水平升高

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRS模型組相比對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的絕望及快感缺失等抑郁樣表型(P<0.01)(圖1A,B)。CRS模型小鼠海馬區(qū)中的PARP14蛋白及mRNA表達(dá)水平皆顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1C～E)。同時(shí)，PARP14蛋白和mRNA表達(dá)水平在束縛第14天時(shí)顯著升高(P<0.05)(圖1F,G)。此外，在CUMS模型海馬區(qū)也觀察到PARP14蛋白表達(dá)水平相較于對(duì)照組顯著升高(P<0.05)(圖1H,I)。

Male C57BL/6 mice were exposed to chronic restraint (CRS) model or chronic unpredictable mild stress (CUMS) model induction; A,B.CRS- treated mice and control(Ctrl) mice behaviors: A.forced swim tests, B.sucrose preference tests(n=9); C,D.PARP14 levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains, n=3 experimental replicates/group; E.PARP14 mRNA levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains(n=5); F,G.PARP14 protein and mRNA levels in mice hippocampus at different restraint time points (0D: CRS 0 day, 1D: CRS 1 day, 3D: CRS 3 day, 5D: CRS 5 day, 7D: CRS 7day dand 14D: CRS 14 day)， #P<0.05 compared with CRS 0 day group; H,I.PARP14 levels in hippocampus of CUMS/Ctrl mouse brains(n=3); *P<0.05, **P<0.01 compared with Ctrl group圖1 CRS和CUMS模型海馬區(qū)PARP14的表達(dá)水平升高Fig 1 PARP14 levels were increased in the hippocampus of CRS and CUMS

2.2 PARP14與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)

在CRS模型小鼠海馬組織中，炎性因子IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2A)，且PARP14與IL-1β mRNA表達(dá)水平正相關(guān)(r=0.868,P<0.05)。LPS模型小鼠海馬中，PARP14 mRNA和蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2B,C)。BV2細(xì)胞中，PARP14 mRNA表達(dá)水平在LPS刺激3、6和12 h后均有顯著升高(P<0.01)(圖3A)；同時(shí)，PARP14蛋白表達(dá)水平在LPS處理6 h后顯著升高(P<0.05)(圖3B,C)。

A.IL-1β mRNA levels in the hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains; B.PARP14 mRNA levels in the hippocampus of mice treated with LPS or saline; C.PARP14 protein levels in hippocampus of LPS/control mouse brains； *P<0.05 compared with Ctrl group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with saline group圖2 PARP14表達(dá)水平與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)Fig 2 PARP14 expression was related to neuroinflammatory n=4)

A.PARP14 mRNA expression in BV2 cells with LPS treated in different times(0, 3, 6, 12 hours); B,C.PARP14 expression in PBS and LPS group(PSB: BV2 cells treated with PBS in 6 hours, LPS: BV2 cells treated with LPS in 6 hours; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with PBS group圖3 BV2細(xì)胞LPS刺激后PARP14表達(dá)水平升高Fig 3 PARP14 levels were up-regulated in LPS treated BV2 n=3)

2.3 BV2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PARP14增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)

BV2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)組PARP14 mRNA水平顯著升高(P<0.001)(圖4A)。經(jīng)6 h LPS處理，PARP14過(guò)表達(dá)組產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA顯著升高(P<0.01)(圖4B)，同時(shí)抑炎細(xì)胞因子白介素10(IL-10) mRNA表達(dá)有下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4C)。

2.4 BV2細(xì)胞中敲低Parp14和抑制劑處理降低LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)

在BV2細(xì)胞中，敲低組PARP14 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)(圖4D)。與過(guò)表達(dá)組相反，敲低組LPS處理后促炎細(xì)胞因子IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)， 且IL-10mRNA水平有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4E,F)。LPS刺激BV2細(xì)胞后，PARP14抑制劑GeA-69處理相較于無(wú)抑制劑對(duì)照組，其促炎因子IL1-β mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖4G)，同時(shí)TNF-α mRNA表達(dá)水平也表現(xiàn)出下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4H,I)。

A.PARP14 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group(EGFP+LPS: BV2 cells over-expression EGFP and then treated with LPS, PARP14+LPS: BV2 cells over-expression PARP14 and then treated with LPS); B.TNF-α mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; C.IL-10 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; D.PARP14 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group(si-NC+LPS: BV2 cells transfected with si-NC and then treated with LPS, si-PARP14+LPS: BV2 cells transfected with si-PARP14 and then treated with LPS); E.IL-1β mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; F.IL-10 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; G.IL-1β mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group(DMSO+LPS: BV2 cells pre-treated with DMSO before treated with LPS, GeA+LPS; BV2 cells pre-treated with 250 nmol/L GeA-69 before treated with LPS); H.TNF-α mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; I.IL-10 mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; *P<0.01, **P<0.001 compared with EGFP+LPS group; #P<0.05 compared with si-NC+LPS group; ▲P<0.01 compared with DMSO+LPS group圖4 BV2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PARP14增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)Fig 4 PARP14 levels were up-regulated in hippocampus of LPS induced depression models and LPS treated

3 討論

海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與許多情緒相關(guān)的腦區(qū)(如前額葉皮層和杏仁核)形成神經(jīng)纖維連接，是當(dāng)前抑郁障礙相關(guān)研究較多的一個(gè)腦區(qū)[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)CRS和CUMS兩種慢性應(yīng)激小鼠模型海馬中PARP14的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)引起PARP14表達(dá)升高，證實(shí)了海馬區(qū)PARP14表達(dá)水平與抑郁癥的相關(guān)性。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)CRS模型海馬區(qū)存在IL-1β mRNA表達(dá)水平的升高，這與神經(jīng)炎性假說(shuō)中慢性應(yīng)激引發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)的觀點(diǎn)相符[6]。重要的是，本研究也發(fā)現(xiàn)了PARP14 mRNA表達(dá)水平與IL-1β mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示PARP14可能會(huì)通過(guò)影響神經(jīng)炎性反應(yīng)從而對(duì)抑郁癥產(chǎn)生影響。本研究在LPS模型中的發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了PARP14與神經(jīng)炎性相關(guān)的假設(shè)。

由于小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的炎性反應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型，在慢性應(yīng)激情況下，與抑郁癥相關(guān)的大腦區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榛顒?dòng)狀態(tài)，這也被認(rèn)為是造成壓力期間中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的重要原因[12]。當(dāng)使用LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，也觀察到了PARP14蛋白及其mRNA表達(dá)水平的升高，這提示PARP14可能在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮作用從而影響神經(jīng)炎性反應(yīng)。當(dāng)改變小膠質(zhì)細(xì)胞PARP14表達(dá)后觀察到了其響應(yīng)LPS刺激后炎性反應(yīng)的變化， PARP14在小膠質(zhì)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以以通過(guò)增加促炎基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)；而Parp14在小膠質(zhì)細(xì)胞中的敲低或抑制可以通過(guò)抑制促炎基因的表達(dá)從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)PARP家族的macro亞家族成員PARP14與抑郁癥的相關(guān)性，并提示其可能通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化而對(duì)抑郁樣行為產(chǎn)生影響，但其影響小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的機(jī)制仍然有待研究。雖然之前已發(fā)現(xiàn)一些以抑制PARP1為主的PARP家族抑制劑在一些案例中起到了緩解抑郁癥癥狀的作用[2]。但不同于PARP1介導(dǎo)的多聚ADP核糖基化修飾的廣泛作用[13]，PARP14介導(dǎo)的單ADP核糖基化修飾作用可能更為特異，因此其特異性抑制劑潛在的副作用可能也會(huì)更小。本研究表明PARP14很有可能成為抑郁癥治療有希望的靶標(biāo)。