劉洪憲，楊 雋

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)系，浙江 杭州 310058)

肺部疾病相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓(lung disease associated pulmonary hypertension)是一類(lèi)肺動(dòng)脈相關(guān)疾病，表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)與肺間質(zhì)發(fā)生不可逆的病變，肺移植則是該類(lèi)疾病晚期患者治療的主要方案。但是由于供體缺少，大多數(shù)患者無(wú)法得到配型符合的健康肺[1-2]。人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)具有多能性，利用hESCs分化得到肺細(xì)胞一方面可以研究相關(guān)肺部疾病的發(fā)生機(jī)制；另一方面其有望成為可移植的種子細(xì)胞[3-4]。

研究表明，囊狀期肺遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞中存在一群DNA結(jié)合抑制因子-2(inhibitor of DNA binding-2, ID2)陽(yáng)性的多能性細(xì)胞，這群細(xì)胞能夠分化成肺泡和支氣管[5-6]。同時(shí)，肺泡發(fā)生又能夠促進(jìn)肺微血管網(wǎng)的形成和進(jìn)一步成熟[5]。而ID2在肺內(nèi)的表達(dá)時(shí)間遠(yuǎn)早于囊狀期，其在肺發(fā)育早期的作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過(guò)將正常hESCs和構(gòu)建的ID2敲除hESCs系分別向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)和肺芽類(lèi)器官(lung bud organoids, LBOs)定向分化并共培養(yǎng),旨在探討肺芽發(fā)育早期尖端多能干細(xì)胞中ID2對(duì)肺血管分化的調(diào)控作用，為研究相關(guān)肺部疾病發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：mTesR1培養(yǎng)基(Stemcell公司)；0.25%胰蛋白酶、DMEM/F12、RMPI 1640、advanced DMEM/F12和EGM-2培養(yǎng)基、小鼠抗人CXCR4抗體、小鼠抗人CD31抗體、兔抗人VE-cadherin抗體(Thermo Fisher Scientific公司)；小鼠抗人vWF抗體(BD公司)；基質(zhì)膠(Corning公司)；CD31免疫磁珠(Miltenyi Biotec 公司)；ID2抗體(Biocheck公司)；兔抗人GAPDH抗體、兔抗人SOX17抗體、兔抗人PAX9抗體、HRP耦合的二抗(Abclonal公司)。

1.1.2 細(xì)胞來(lái)源：人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)(浙江大學(xué)陳偉實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予)；人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，hPAECs)(北京澤平生物技術(shù)有限公司)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(翊圣生物科技有限公司)。

1.1.3 載體： episomal-CRISPR/Cas9載體(北京賽貝生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hESCs的培養(yǎng)：將hESCs培養(yǎng)于mTesR1培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 ECs的分化及純化培養(yǎng)：待hESCs增殖至約10%匯合度左右后開(kāi)始ECs分化，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]；分化第1天換上中胚層分化培養(yǎng)基(含有25 ng/mL activin A、30 ng/mL BMP4、1.5 mmol/L CHIR99021和50 ng/mL VEGF的BSA polyvinylalcohol essential lipids)；第4天換為ECs分化培養(yǎng)基(含有10 mmol/L SB431542和 50 μg/mL VEGF的BSA polyvinyla-lcohol essential lipids)，隔天換液，直至第10天。10 d 后使用CD31磁珠進(jìn)行ECs分選，純化的ECs在EGM-2培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

1.2.3 LBOs的分化：待hESCs增殖至約90%匯合度以上進(jìn)行LBOs分化，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]；分化前3天使用內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基(含有100 ng/mL activin A 和1.5 mmol/L CHIR99021的RMPI 1640)，每天換液；第4天開(kāi)始換為前腸內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基(含有200 ng/mL Noggin、2 mmol/L CHIR99021、10 mmol/L SB431542和500 ng/mL FGF4的advanced DMEM/F12)。第8天將漂浮的細(xì)胞球轉(zhuǎn)入肺芽類(lèi)器官分化培養(yǎng)液(含有10 ng/mL FGF7、50 μg/mL ascorbic acid、3 mmol/L CHIR 99021和50 μmol/L retinoic acid的DMEM/F12)進(jìn)行3D立體培養(yǎng)，每3～5 d換1次液，連續(xù)培養(yǎng)2周。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平：分別收集ECs分化第0、1.5、3、7、10天和LBOs分化的第0、3、7、21天的細(xì)胞樣品，使用Trizol法提取總RNA，測(cè)定濃度后將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測(cè)ID2、organic cation transporter4(OCT4)、brachyury(T)、kinase insert domain receptor(KDR)、platelet and endothelial cell adhesion molecule 1(CD31)、C-X-C motif chemokine receptor 4(CXCR4)、SRY-Box transcription factor 2(SOX2)、SOX9、NK2homeobox 1(NKX2.1)、cadherin 5(CD144)、von Willebrand factor(vWF)、SOX17和Paired Box 9(PAX9)的mRNA表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers for quantitative PCR

1.2.5ID2敲除株C6的建立：利用epiCRISPR載體和ID2特異gRNA(5′-GGCATCTCCCGGAGCAAA A-3′)構(gòu)建敲除載體，將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到hESCs中，puromycin篩選挑取單克隆培養(yǎng)。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：分別收集ECs分化第0、1.5、10天和LBOs分化的第0、3、7天的細(xì)胞樣品，使用RIPA裂解細(xì)胞收集總蛋白，將樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、相應(yīng)蛋白一抗孵育、二抗孵育和顯影拍照，檢測(cè)ID2、EOMES、CD31、CD144、SOX17和PAX9的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)CXCR4和CD31的陽(yáng)性率：分別收集ECs分化第10天和LBOs分化第3天細(xì)胞，流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)ECs表面分子CD31和內(nèi)胚層細(xì)胞表面分子CXCR4陽(yáng)性的細(xì)胞比例。

1.2.8 ECs和hPAEC成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成管能力：用胰蛋白酶消化細(xì)胞，在預(yù)先用基質(zhì)膠包被的96孔板中種植細(xì)胞，每孔15 000個(gè)細(xì)胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，4 h后拍照觀察并使用ImageJ進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9 LBOs和hPAECs的3D共培養(yǎng)檢測(cè)LBOs對(duì)hPAECs成管功能的影響：將LBOs與hPAECs(每孔60 000個(gè)細(xì)胞)混合后，在細(xì)胞混合液中加入100 μL基質(zhì)膠，隨后將細(xì)胞混合液接種于預(yù)冷的96孔板中；待其凝固后添加EGM-2培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，24 h后拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 從hESCs分化得到ECs與LBOs及相關(guān)鑒定

ECs分化第1.5天細(xì)胞完全鋪散開(kāi)，直至第7天開(kāi)始出現(xiàn)典型的鋪路石狀的ECs(圖1A)。分化過(guò)程中，中胚層基因T在第1.5天高表達(dá)，ECs標(biāo)志基因CD31和KDR在第7天表達(dá)最高,ID2的表達(dá)水平在ECs分化過(guò)程中逐漸升高，在第7天達(dá)到最高(圖1B)。

hESCs分化第21天得到LBOs(圖1C)。分化過(guò)程中，內(nèi)胚層基因CXCR4在第3天達(dá)到峰值，前腸內(nèi)胚層基因SOX2在第7天達(dá)到峰值，成熟的LBOs高表達(dá)SOX9和NKX2.1，ID2在LBOs分化過(guò)程中逐漸升高(圖1D)。

A.images of hESCs differentiated into ECs on different days (scale bar =100μm); B.mRNA expression of marker genes during ECs differentiation; C.images of hESCs differentiated into LBOs on different days (scale bar=100 μm); D.mRNA expression in marker genes during LBOs differentiation圖1 從hESCs分化得到ECs與LBOs及相關(guān)鑒定Fig 1 Differentiation and identification of ECs and LBOs from n=3)

2.2 敲除ID2能夠延緩hESCs進(jìn)入中胚層而促進(jìn)終末ECs分化

ECs分化第1.5天C6細(xì)胞未正常散開(kāi)呈克隆樣(圖2A)。與正常hESCs(H9)相比，C6中中胚層基因T、KDR的mRNA表達(dá)和EOMES蛋白表達(dá)相對(duì)較低(圖2B，C)。與正常hESCs(H9)相比，ECs分化第10天C6的分化所得CD31+細(xì)胞數(shù)量顯著增多，約為31%(圖2D)。ECs中的基因CD31、CD144和vWFmRNA和蛋白表達(dá)水平均在C6中表達(dá)較高(圖2E，F(xiàn))。

A.images of different cell strains differentiated into ECs on day1.5 (D1.5,scale bar=100 μm); B.relative mRNA expression of mesoderm gene in A; C.protein expression of mesoderm gene EOMES and ID2 in A; D.CD31 expression level of different cell strains on ECs differentiation D10; E.relative mRNA expression of ECs gene on ECs differentiation D10 in different cell strains; F.protein expression of ECs genes on ECs differentiation D10 in different cell strains; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with H9.H9，normal hESCs;C6, ID2 knockout strain圖2 敲除ID2能夠延緩hESCs進(jìn)入中胚層而促進(jìn)終末ECs分化Fig 2 ID2 knockout delayed hESCs entry into the mesoderm, but promoted differentiation into n=3)

2.3 敲除ID2減弱ECs成管功能

2種細(xì)胞株來(lái)源的ECs呈現(xiàn)典型的鋪路石形狀(圖3A)。盡管它們均能形成管狀結(jié)構(gòu)，但敲除ID2的C6細(xì)胞株分化得到的ECs成管的各項(xiàng)參數(shù)均顯著低于對(duì)照組(H9)(圖3B,C)。

A.images of ECs obtained from different cell strains (scale bar=100 μm); B.comparison of tube-forming ability of ECs obtained from different cell strains (×4); C.quantification of Fig 2B; *P<0.05 compared with H9 group圖3 不同細(xì)胞株來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞成管功能比較Fig 3 Comparison of ECs tubes-forming ability of different cell n=3)

2.4 敲除ID2抑制LBOs的生成

LBOs分化第3天，與對(duì)照組H9相比，ID2敲除后分化效率降低(CXCR4+約60%)(圖4A)；內(nèi)胚層基因CXCR4和SOX17的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(圖4B,C)。在LBOs分化第7天，與H9組相比C6生成的懸浮球明顯減少(圖4D)，C6的前腸內(nèi)胚層基因PAX9的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(圖4E,F)。

A.CXCR4 expression level of different cell strains during LBOs differentiation D3; B.relative mRNA expression of CXCR4 and SOX17 on LBOs differentiation D3 in different cell strains; C.protein expression of SOX17 on LBOs differentiation D3 in different cell strains; D.images of different cell strains differentiated into LBOs in D7 (scale bar=100 μm); E.relative mRNA expression of PAX9 and SOX2 on LBOs differentiation D7 in different cell strains; F.protein expression of PAX9 on LBOs differentiation D7 in different cell strains; *P<0.05, **P<0.001 compared with H9 group圖4 敲除ID2抑制LBOs的生成Fig 4 ID2 knockout inhibited the formation of n=3)

2.5 ID2正向調(diào)控LBOs誘導(dǎo)ECs成管功能

LBOs培養(yǎng)上清能夠促進(jìn)hPAEC成管，與H9組相比C6的促進(jìn)作用相對(duì)減弱(圖5A,B)。正常的LBOs能夠促進(jìn)ECs成管，出現(xiàn)LBOs與ECs相互接觸的結(jié)構(gòu)；而C6來(lái)源的LBOs促成管作用降低(圖5C,D)。

A.comparison of tube-forming ability of hPAECs cultured in different LBOs culture medium (×4); B.quantification of Fig 5A; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with H9 group; C.comparison of morphological differences and tube-forming ability by LBOs derived from different cell strains and hPAECs 3D co-culture (×10); the red arrow was the LBOs, the green arrow was the tubular structure formed by ECs; D.quantification of Fig 5C; ***P<0.01 compared with H9 group圖5 ID2正向調(diào)控LBOs誘導(dǎo)ECs成管功能Fig 5 ID2 positively regulated the LBOs induction of ECs tube n=3)

3 討論

本研究顯示ID2參與肺的早期發(fā)育，主要表現(xiàn)在促進(jìn)LBOs和ECs的早期分化及參與LBOs對(duì)肺血管形成的調(diào)控作用。ID2敲除后一方面不利于hESCs分化進(jìn)入中胚層階段， 形成大量成管能力缺陷的ECs；另一方面導(dǎo)致LBOs的形成減少和功能降低。

hESCs向ECs定向分化主要形成兩種不同的中胚層來(lái)源的細(xì)胞，ECs和周細(xì)胞。盡管ID2能夠促進(jìn)hESCs更早進(jìn)入中胚層，但卻更有利于向周細(xì)胞分化。因此ID2敲除形成大量的功能缺陷的ECs，這種現(xiàn)象可能會(huì)引起肺動(dòng)脈高壓等血管疾病。

研究進(jìn)一步顯示，ID2能夠正向調(diào)控LBOs誘導(dǎo)ECs成管功能。LBOs的這種誘導(dǎo)作用可能是以通過(guò)分泌VEGF等信號(hào)分子的旁分泌方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，ID2的敲除可能阻斷了這一信號(hào)分子的表達(dá)和分泌。作為BMP信號(hào)通路(bone morphogenetic protein signaling pathway)的下游基因，ID2相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的問(wèn)題需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究探討了ID2在肺早期發(fā)育中的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究相關(guān)肺血管疾病提供了理論依據(jù)。