陳麗芝，姜 偉，施文靜，祁擁華，葉春宇，范瑞良，李楠楠，全為民

（1.三門縣水產(chǎn)技術推廣站，浙江三門 317100；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；4.三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江三門 317100）

牡蠣是中國乃至全球產(chǎn)量最高的貝類，廣泛分布于亞熱帶和溫帶的潮間帶和潮下帶淺水區(qū)。除了經(jīng)濟價值外，牡蠣也是重要的海岸帶“生態(tài)系統(tǒng)工程師（ecosystem engineer）”之一，具有凈化水體、營造生境、防護岸線、固碳等生態(tài)系統(tǒng)服務功能［1-3］。牡蠣的生活史分為浮游幼體階段和底棲固著階段，成年牡蠣釋放的卵子完成受精孵化后，經(jīng)過14～20 d左右的浮游生活發(fā)育到具足面盤幼體階段時，就選擇硬底物附著開始營固著生活［4-6］。

健跳港是浙江中部三門灣內的一條狹長而彎曲的內港，是典型的海灣型淤泥質潮汐汊道，上游開闊、下游窄深，整個港域地形呈壺形，全長約17 km，總面積16.7 km2，其中水域面積8.7 km2［7］。健跳港的上游灣區(qū)水質較好、初級生產(chǎn)力較高、貝類資源豐富，是三門縣牡蠣、菲律賓蛤仔（Ruditapesphilippinarum）和縊蟶（Sinonovacula constricta）的重要增養(yǎng)殖基地和采苗場。該灣尤以盛產(chǎn)“鐵強牡蠣”（生物學名為熊本牡蠣Crassostreasikamea）和近江牡蠣（C.ariakensis）而聞名，被三門縣列為牡蠣種質資源保護基地。但近幾十年來，由于流域開發(fā)和過度采捕等多重干擾，健跳港上游灣區(qū)牡蠣的棲息生境減少、資源量下降、種群衰退，影響了當?shù)啬迪牱N質保護與利用。

為掌握當?shù)啬迪犢Y源分布狀況，本研究采用定量方法調查健跳港上游灣區(qū)牡蠣沿潮間帶高程梯度的垂直分帶（zonation）格局、并運用野外生態(tài)實驗檢驗附苗器類型和采苗地點對牡蠣資源補充的影響，推薦適宜的附苗器類型和采苗地點，以期對闡明牡蠣的生物生態(tài)特性以及資源保護利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 研究地點

研究地點位于浙江省三門縣健跳港的上游灣區(qū)（圖1）。灣內潮汐特征為非正規(guī)半日潮、潮性系數(shù)為0.28，春季平均潮差為4.11 m，夏季平均潮差達4.36 m，平均漲潮歷時大于平均落潮歷時，歷時差在15 min以內［7］。灣內海水水溫介于5.2～30.1℃，鹽度介于3.5～15.1。

牡蠣潮間帶分帶調查采樣地點位于上游灣區(qū)北側、緊鄰六橫線的人工巖相海岸（圖1），該處為利用天然大巖石護岸形成的陡峭石堤，4.6 m潮區(qū)（基準為健跳港潮位站0 m潮位）以下至水邊線均有高密度的牡蠣分布，為研究牡蠣潮間帶分帶提供了良好的場所。牡蠣資源補充實驗共設置2個實驗點，S1點位于上游灣區(qū)東側的灘涂潮溝內，S2位于上游灣區(qū)北側的米草灘涂邊緣，2個采苗點處于同樣的潮區(qū)（圖1）。

1.2 牡蠣潮間帶分帶調查

2020年10月17日14∶00—17∶00（大潮汛期低潮時段）進行潮間帶牡蠣定量采樣，沿該處巖相岸線由南至北平行設置3條斷面，相鄰斷面間相距不小于20 m；基于牡蠣分布的潮區(qū)范圍（1.4～4.6 m），沿降低的高程梯度在每條斷面上按0.8 m間隔設置5個潮區(qū)，分別標記為4.6 m（牡蠣聚集分布的上界）、3.8 m、3.0 m、2.2 m和1.4 m（水邊線處），每個潮區(qū)采集1個15 cm×15 cm樣方內的所有活體牡蠣，裝于密封袋內帶回實驗室分析。

室內分析每個樣品中活體牡蠣的種類、數(shù)量和大小。采用形態(tài)和分子生物學方法鑒定牡蠣種類［6，8-9］，大部分熊本牡蠣可以根據(jù)外殼形態(tài)確定其種類，對于部分外殼形態(tài)特征較模糊的牡蠣樣本，采用線粒體16S rDNA基因序列分析確定其種類。采集牡蠣閉殼肌100 mg于1.5 mL離心管中，置于-80℃保存?zhèn)溆茫皇褂煤Ｑ髣游锝M織基因組DNA提取試劑盒（天根）提取牡蠣基因組DNA，參照PALUMBI等［10］設計的引物（16Sar：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′，16Sbr：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′），以 基 因 組DNA為模板，擴增牡蠣16S rDNA片段；PCR擴增產(chǎn)物用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海生工生物工程有限公司進行測序；測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，確定牡蠣物種。牡蠣密度（個·m-2）表示為每1 m2內牡蠣的數(shù)量。使用游標卡尺測量每個牡蠣樣品的殼高（mm），精確至0.1 mm。

1.3 牡蠣資源補充量監(jiān)測實驗

本實驗于2020年8月2日—10月17日期間開展。采用雙因子隨機區(qū)組設計，2個自變量為采苗地點（S1和S2）和附苗器類型（水泥片和塑膠輪胎）。水泥片規(guī)格為10 cm×10 cm×1 cm，由混凝土制作而成；塑膠輪胎由舊自行車輪胎切割制作成的圓環(huán)狀附苗器（內徑40 cm，外徑30 cm）。2020年8月2日在每個采苗點的人工附苗筏架上吊掛12個水泥片和3個塑膠輪胎，相鄰附苗器間相距不小于5 m，且使所有附苗器處于相同潮區(qū)。2020年10月17日回收實驗附苗器，室內統(tǒng)計每個附苗器上活體牡蠣數(shù)量；在每個采苗點，每種附苗器上隨機挑取30個牡蠣苗，利用分子生物學方法鑒定牡蠣種類，使用游標卡尺隨機測量不少于40個牡蠣苗的殼高（mm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

牡蠣密度和殼高數(shù)據(jù)經(jīng)lg（x＋1）轉換后，進行正態(tài)（normality test）和齊差性（equal variance test）檢驗。如通過檢驗，采用一維方差分析（oneway ANOVA）檢驗每種牡蠣密度沿高程梯度的垂直變化，運用Duncan多重比較對5個潮區(qū)間的差異進行檢驗（α＝0.05）；對于多種牡蠣共存的潮區(qū)，采用一維方差分析檢驗牡蠣種類間密度的差異（α＝0.05）；如未通過檢驗，則采用一維排序方差分析（one-way ANOVA on rank）進行統(tǒng)計分析。采用兩維方差分析（two-way ANOVA）檢驗采苗地點和附苗器類型對牡蠣苗密度和殼高的影響，再運用Duncan多重比較進行顯著性檢驗（α＝0.05）。所有數(shù)據(jù)分析均采用Sigmaplot 10.0軟件計算。

2 結果與分析

2.1 牡蠣的潮間帶分帶格局

潮間帶定量調查共記錄到3種牡蠣，即熊本牡蠣、近江牡蠣和香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）（圖2）。其中，熊本牡蠣在調查的5個潮區(qū)均有分布，近江牡蠣和香港牡蠣僅分布于最底層的1.4 m和2.2 m潮區(qū)（圖3）。

熊本牡蠣平均密度沿增加的高程梯度呈現(xiàn)上升趨勢（圖3-A）；一維方差分析結果顯示，熊本牡蠣密度在不同潮區(qū)間具有顯著性差異（圖3-A，F(xiàn)4，10＝3.561，P＝0.047）。其中4.6 m潮區(qū)熊本牡蠣平均密度最大［（1 689±603）個·m-2］，顯著高于1.4 m［（163±141）個·m-2］和2.2 m［533±136）個·m-2］潮區(qū)（P＜0.05），而在后2個潮區(qū)間熊本牡蠣密度沒有顯著性差異（P＞0.05）；3.0 m［（1 230±189個·m-2］和3.8 m［（1 600±438）個·m-2］潮區(qū)的熊本牡蠣密度介于中間，與其他3個潮區(qū)之間均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

近江牡蠣（圖3-B）和香港牡蠣（圖3-C）平均密度在1.4 m［近江牡蠣：（44±44）個·m-2；香港牡蠣：（133±89）個·m-2］和2.2 m［近江牡蠣：（15±15）個·m-2；香港牡蠣：（30±30）個·m-2］潮區(qū)間均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

在2.2 m潮區(qū)，3種牡蠣密度的大小順序為：熊本牡蠣＞近江牡蠣＝香港牡蠣（圖3），且熊本牡蠣密度顯著高于其他2種牡蠣的總密度（P＜0.05），表明該潮區(qū)仍然以熊本牡蠣為優(yōu)勢種；在1.4 m潮區(qū)，熊本牡蠣與其他2種牡蠣的總密度之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明在1.4 m潮區(qū)3種牡蠣共存（圖3）。

圖2 熊本牡蠣（CS）、近江牡蠣（CA）和香港牡蠣（CH）的原色圖Fig.2 Color images of Crassostrea sikamea（CS），C.ariakensis（CA）and C.hongkongensis（CH）

圖3 沿潮間帶高程梯度熊本牡蠣（A）、近江牡蠣（B）和香港牡蠣（C）密度（平均值±標準誤）的變化Fig.3 Changes in densities（mean±SE）of Crasssostrea sikamea（A），C.ariakensis（B）and C.hongkongensis（C）along the tidal elevation gradient

一維排序方差分析結果顯示，牡蠣殼高在各潮區(qū)間沒有顯著性差異（圖4，P＝0.172）。

2.2 牡蠣資源補充量的變化

在2個實驗點附著的牡蠣苗均為熊本牡蠣，并未檢測到近江牡蠣和香港牡蠣。

二維方差分析結果顯示，采苗地點（F1，26＝52.285，P＜0.001）和 附 苗 器 類 型（F1，26＝10.658，P＝0.003）均顯著影響牡蠣苗密度，2因子之 間 存 在 互 作 效 應（F1，26＝76.673，P＜0.001）。在S1采苗點，2種附苗器間牡蠣苗密度沒有差異（圖5，q＝1.526，P＞0.05）；在S2采苗點，牡蠣苗密度大小順序為：水泥片＞塑膠輪胎（圖5，q＝15.987，P＜0.05）。在2個采苗點間水泥片上牡蠣苗密度的大小順序為：S1＜S2（圖5-A，P＜0.05）；而塑膠輪胎上牡蠣苗密度的大小順序為：S1＞S2（圖5-B，P＜0.05）。

二維方差分析結果顯示，采苗地點（F1，186＝29.568，P＜0.001）和 附 苗 器 類 型（F1，186＝125.082，P＜0.001）均顯著影響著牡蠣苗殼高，2因子之間沒有互作效 應（F1，186＝3.103，P＝0.080）。在每個采苗點，牡蠣苗平均殼高的大小順序均為：水泥片＞塑膠輪胎（圖6，S1：q＝6.996，P＜0.05；S2：q＝3.789，P＜0.05）。2個采苗點間每種附苗器上牡蠣苗平均殼高的大小順序均為：S1＞S2（圖6，P＜0.05）。

圖4 沿潮間帶高程梯度牡蠣殼高（SH）的頻率分布Fig.4 Frequency distribution in shell height（SH）of oysters along the tidal elevation gradient

圖5 2個采苗點中水泥片（A）和塑膠輪胎（B）上牡蠣苗密度（平均值±標準誤）的比較Fig.5 Com parison in m ean densities（mean±SE）of oyster spats settled on the concrete tiles（A）and p lastic rings（B）at two experimental sites

3 討論

3.1 牡蠣物種多樣性

中國沿海牡蠣種類繁多，且由于牡蠣表型變化大，導致牡蠣物種鑒定及系統(tǒng)分類十分困難［11-12］?，F(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展為牡蠣物種鑒定提供了可靠的方法途徑［11-12］。本研究從健跳港上游灣區(qū)潮間帶定量采樣中鑒定出熊本牡蠣、近江牡蠣和香港牡蠣，再加上定性采樣中發(fā)現(xiàn)的福建牡蠣（C.angulata）①本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù)。，可以確定該灣區(qū)分布有4種牡蠣，在浙江和福建兩省常見的4種巨蠣屬（Crassostrea）牡蠣在該灣內均有發(fā)現(xiàn)［13-14］。近江牡蠣在浙江沿海雖有分布記錄，但采集到的樣本有限，且缺乏較大種群分布的記載。本研究首次發(fā)現(xiàn)近江牡蠣在三門縣健跳港上游灣區(qū)集中分布，是當?shù)貍鹘y(tǒng)牡蠣石條養(yǎng)殖的主要種類之一，表明該灣區(qū)近江牡蠣的種質資源狀況較好。但近幾十年來，上游建庫引水等流域開發(fā)活動使健跳港上游灣區(qū)潮間帶牡蠣棲息地淤積嚴重，適合牡蠣附著生長的棲息地面積減少、棲息地質量下降；另外過度采捕等行為若不加以規(guī)范可能會進一步加劇健跳港上游灣區(qū)牡蠣資源量下降和種群衰退，因此關于牡蠣種質資源保護的研究亟待加強。

圖6 2個采苗點中水泥片（A）和塑膠輪胎（B）上牡蠣苗殼高（SH）的箱形圖Fig.6 Box plots of shell height（SH）of oyster spats settled on the concrete tiles（a）and plastic rings（b）at two experimental sites

香港牡蠣廣泛分布于廣東、廣西及海南沿海低潮線至10 m水深的淺海，前期研究顯示其最北分布區(qū)位于福建九龍江口的海門島和白礁［14］。本研究首次在浙江海域發(fā)現(xiàn)了香港牡蠣的自然分布，是該種目前在我國分布的最北記錄。近年來，“生蠔”（學名為香港牡蠣）養(yǎng)殖在健跳港發(fā)展迅速，從南方移植而來的香港牡蠣苗在健跳港內養(yǎng)殖育肥后即可自然繁育，進而在灣內潮間帶定殖建群，形成當?shù)胤N群。香港牡蠣生長速率快、比本地的近江牡蠣更能耐受低鹽脅迫，具有更強的競爭優(yōu)勢，且與近江牡蠣占據(jù)相同的潮區(qū)；因此，香港牡蠣的快速擴散可能會排擠近江牡蠣的空間生態(tài)位，導致本地近江牡蠣種質資源退化，今后應進一步研究評估香港牡蠣入侵對本地牡蠣資源的影響。

3.2 牡蠣垂直分帶格局

在潮間帶生境中物種的垂直分帶是很常見的現(xiàn)象［15-17］。生物效應（如競爭、捕食）和物理條件（空氣暴露、失水和溫度）是調控牡蠣、藤壺、貽貝等固著型海洋無脊椎動物潮間帶分帶格局的關鍵因子［18-20］?？諝獗┞锻ǔQ定著牡蠣垂直分布的上限（upper limit），而生物作用（如競爭和捕食）通常調控牡蠣垂直分布的下限（lower limit）。已有研究表明［6，21］，熊本牡蠣和近江牡蠣具有明顯的潮間帶分帶格局，總體上近江牡蠣分布于低潮區(qū)，而熊本牡蠣占據(jù)中潮區(qū)。WANG等［6］首次揭示了兩種牡蠣分布的最適潮區(qū)和潮間帶分帶邊界，即平均56%和42%空氣暴露潮區(qū)分別代表熊本牡蠣生長的最適潮區(qū)和分布下限，42%空氣暴露是兩種牡蠣分布的邊界，并從生理生態(tài)上證明了熊本牡蠣比近江牡蠣具有更強的耐干能力。本研究結果進一步驗證了上述結論，發(fā)現(xiàn)熊本牡蠣、近江牡蠣和香港牡蠣具有明顯的潮間帶分帶格局，即近江牡蠣和香港牡蠣僅分布于最底層的兩個潮區(qū)（2.2 m和1.4 m），且這2種牡蠣的平均密度隨著高程降低而逐步增加，它們的潮間帶分布上限均為2.2 m潮區(qū)；熊本牡蠣最高密度出現(xiàn)于4.6 m潮區(qū)，且隨著高程降低其密度逐步下降，表明一定程度的空氣暴露有利于熊本牡蠣種群發(fā)育。

3.3 牡蠣資源補充的影響因素

牡蠣采苗場一般位于其產(chǎn)卵場上游，然而這種水平輸送過程通常與牡蠣的行為、水動力條件、海底地形等因素有關，不同種類或地點間牡蠣空間分布格局差異較大［3，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，水泥片上牡蠣附苗量表現(xiàn)為：下游采苗點（S2）附苗量顯著高于上游采苗點（S1），而塑膠輪胎上牡蠣附苗量卻呈現(xiàn)相反結果，這可能與投放的牡蠣附苗器數(shù)量和附苗器周圍局部流場有關，另外過于分散的牡蠣產(chǎn)卵場也可能導致地點間附苗量沒有一致的規(guī)律。但總體上，上游采苗點牡蠣苗殼高顯著大于下游采苗點，表明上游牡蠣苗的生長速率高于下游，因此本研究認為上游S1點是較適宜的熊本牡蠣采苗場。

底物（substrate）的化學元素組成顯著影響著牡蠣幼蟲的附著及變態(tài)發(fā)育，特別是底物中的鈣元素是牡蠣幼蟲附著的主要誘因之一，通常自然含鈣底物（石灰石、貽貝殼、蛤蜊殼和石膏）附苗效果優(yōu)于其他底物（如砂石、輪胎、玻璃纖維和不銹鋼等）［5，23］。本研究發(fā)現(xiàn)，上游采苗點中2種附苗器上牡蠣苗密度沒有差異，但在下游采苗點中水泥片牡蠣苗密度顯著高于塑膠輪胎，且在2個采苗點中水泥片上牡蠣苗的殼高均大于塑膠輪胎，表明水泥片總體附苗效果優(yōu)于塑膠輪胎；另外從環(huán)境友好角度考慮，應優(yōu)先推廣使用水泥片附苗器。