孟憲琦，岳 鑫，王曉琴

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

貓頭刺又名鬼見(jiàn)愁、老虎爪子，為豆科棘豆屬貓頭刺（Oxytropis aciphyllaLedeb.）的全草，矮小半灌木，是蒙古高原荒漠化草原區(qū)的特征物種，生于海拔1000～3250 m的礫石質(zhì)平原、薄層沙地、丘陵坡地及砂荒地上，分布于內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆等省區(qū)［1］。莖葉搗碎煮汁可治膿瘡［2-3］。

棘豆屬植物全世界有300 多種，我國(guó)分布有150 多種。該屬植物化學(xué)成分類型多樣，包括黃酮類、皂苷類、生物堿、木脂素、酚酸類等［4-5］。許多植物具有顯著的藥理活性，在民間，尤其是在蒙藥和藏藥中有著悠久的使用歷史。棘豆屬植物的國(guó)內(nèi)外研究較多，但關(guān)于這一荒漠草原建群植物貓頭刺的藥學(xué)研究國(guó)內(nèi)外較罕見(jiàn)［6-7］。已有的研究表明黃酮類成分是棘豆屬藥用植物的主要活性成分［8-11］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鹽酸鎂粉顯色反應(yīng)初步確定貓頭刺中含有黃酮類化合物，因此本研究首次對(duì)貓頭刺的總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)選，并建立了紫外分光光度法測(cè)定其總黃酮含量的有效方法，期望為貓頭刺藥材進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器AL-204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；UVmini-1280 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)［島津儀器（蘇州）有限公司］；KQ-500E超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；SB-1300型水浴鍋（上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥材實(shí)驗(yàn)用的4 批貓頭刺藥材均在內(nèi)蒙古地區(qū)采集，陰干，經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為貓頭刺Oxytropis aciphyllaLedeb.的干燥全草，本研究建立含量測(cè)定方法和黃酮單因素實(shí)驗(yàn)考察所用藥材均為4 號(hào)樣品。芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20981）；三乙胺（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，乙醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；甲醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠），以上試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備取干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品5 mg，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度。精密吸取0.5 mL 溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得50 μg/mL的芹菜素對(duì)照品溶液，貯藏于4℃冰箱備用。

2.2 供試品溶液的制備取干燥的貓頭刺藥材粉末（粉碎過(guò)4號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇25 mL，超聲提取40 min，搖勻，并過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 三乙胺顯色法和測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇1 mL，加1%三乙胺溶液定容至刻度，以隨行試劑為空白對(duì)照，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明對(duì)照品溶液與供試品溶液均在395 nm處有最大吸收，且干擾較小，故選擇395 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取芹菜素對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，在395 nm 處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程Y=0.1139X-0.0119（r=0.9999）。芹菜素在2.5～15.0 μg/mL 范圍內(nèi)與A值呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測(cè)定吸光度A，重復(fù)操作6 次，結(jié)果測(cè)得供試品溶液吸光度A 的RSD 為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別于10、20、30、40、50、60、90 min 內(nèi)按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，以顯色劑為空白，在395 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算總黃酮平均含量的RSD為0.61%，表明樣品溶液在90 min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，共6 份，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測(cè)定吸光度A，計(jì)算總黃酮平均含量的RSD為0.43%，表明本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率 試驗(yàn)取已知含量的貓頭刺藥材粉末9 份（n=3），各約0.1 g，精密稱定，分別按已知總黃酮含量的80%、100%、120% 3 個(gè)水平加入芹菜素對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 總黃酮提取條件單因素考察

2.5.1 提取溶劑 篩選取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，9 份，精密稱定，置于 50 mL 具塞錐形瓶中，分別以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及 30%、50%、70%、100%的乙醇各 25 mL 為提取溶劑，超聲30 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，按“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，依次為 1.890、1.206、1.216、1.703、1.435、1.407、1.905、1.853、0.982 mg/g。結(jié)果顯示以50%的乙醇為提取溶劑時(shí)，總黃酮提取率最高。在此基礎(chǔ)上，又篩選了三個(gè)水平乙醇濃度40%、50%、60%，結(jié)果顯示總黃酮含量依次為1.520、1.905、1.891 mg/g，因此選用50%乙醇溶液作為最佳提取溶劑，見(jiàn)圖3。

圖3 貓頭刺總黃酮提取溶劑的考察

2.5.2 提取方法的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，2 份，精密稱定，置50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 50%乙醇。1 份加熱回流提取30 min，搖勻，并過(guò)濾；另1 份超聲30 min，搖勻，并過(guò)濾。按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，按“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果顯示回流提取效果略好，但兩種提取方法測(cè)得含量相差不大，考慮操作簡(jiǎn)便快捷，所以確定提取方法為超聲提取。

2.5.3 浸泡時(shí)間的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，4 份，精密稱定，加入 25 mL 50%乙醇后，浸泡時(shí)間分別為0、30、60、90 min，超聲提取30 min，搖勻，并過(guò)濾。按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，按“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，依次為2.362、2.206、2.246、2.097 mg/g。結(jié)果顯示，樣品不浸泡時(shí)，總黃酮含量測(cè)定值最高，見(jiàn)圖4。

圖4 貓頭刺總黃酮浸泡時(shí)間的考察

2.5.4 提取時(shí)間的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，5 份，精密稱定，加入25 mL 50%乙醇后，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，搖勻，并過(guò)濾。按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，按“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮平均含量，依次為2.030、1.977、2.104、2.036、1.998 mg/g，結(jié)果顯示，提取時(shí)間為40 min 時(shí)，樣品溶液總黃酮含量測(cè)定值最高，見(jiàn)圖5。

圖5 貓頭刺總黃酮超聲時(shí)間的考察

2.5.5 取樣量的篩選 分別取貓頭刺粉末約0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，精密稱定，加入25 mL 的50%乙醇，超聲40 min，搖勻，并過(guò)濾。按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，按“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮平均含量，依次為2.446、2.260、1.917、2.050、2.104 mg/g，結(jié)果顯示當(dāng)取樣量約為0.2 g 時(shí)，總黃酮含量測(cè)定值最高。

2.6 貓頭刺藥材總黃酮的含量測(cè)定取0.2 g不同產(chǎn)地的樣品各3 份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測(cè)定吸光度A，計(jì)算不同產(chǎn)地的貓頭刺總黃酮的平均含量，見(jiàn)表2。

表2 貓頭刺總黃酮的含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察直接測(cè)定法、三氯化鋁顯色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法和三乙胺顯色法，對(duì)于測(cè)定貓頭刺總黃酮的適用性，結(jié)果表明樣品溶液與對(duì)照品溶液經(jīng)三乙胺顯色法顯色后均在395 nm處有最大吸收且吸收峰明顯，無(wú)雜峰干擾，因此本實(shí)驗(yàn)將三乙胺顯色法確定為測(cè)定貓頭刺總黃酮含量的顯色方法。三乙胺顯色法的原理是當(dāng)黃酮類化合物的羥基解離時(shí)，可以和三乙胺進(jìn)行穩(wěn)定的結(jié)合，從而進(jìn)行檢測(cè)，此顯色方法的專屬性和準(zhǔn)確性均較高［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了采用紫外分光光度法測(cè)定貓頭刺總黃酮含量方法，操作方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確度高，實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性較高；并且初步探索了貓頭刺總黃酮的提取條件，對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化。貓頭刺為季節(jié)性有毒植物，具有藥用價(jià)值，目前對(duì)其化學(xué)成分研究鮮見(jiàn)報(bào)道，期望本研究結(jié)果可以為其資源開(kāi)發(fā)與利用提供可靠的參考。