史 明，張文捷，李 健，李同林，張 勇，羅 滿

廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院/廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院/廣西壯瑤藥技術(shù)研究中心,廣西 南寧 530023

原發(fā)性I 型骨質(zhì)疏松癥（primary osteoporosis，PMOP）屬于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，雌激素替代療法（estrogen replacement therapy，ERT）是目前臨床治療PMOP 的重要方法之一，其主要通過抑制破骨細(xì)胞活性而防治PMOP，臨床應(yīng)用已久，療效可靠。壯藥扶芳藤Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz 含有類雌激素樣成分，這在一些研究中得到了證實(shí)。瞿發(fā)林等［1］、楊穎達(dá)［2］均從扶芳藤中提取到了黃酮苷類化合物，而黃酮類成分作為一種類雌激素成分，為防治PMOP 提供了一種新的可能。因此，本研究對(duì)扶芳藤提取物調(diào)控體外骨代謝的作用做了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇出生后3～5 天的SD 大鼠6只，廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK 桂2019-0001。大鼠購進(jìn)后飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料常規(guī)飼養(yǎng)，觀察1 周無異常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由攝食飲水，室溫控制在20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 試藥與試劑扶芳藤提取物（自行制備），采用文獻(xiàn)［3］中乙醇法提取純化制作扶芳藤乙醇提取物浸膏；胰蛋白酶（上海兆吉生物科技有限公司，批號(hào)：140615）；最低基本（Minimum Essential Medium，MEM）培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號(hào)：21700075）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號(hào)：16010-159）；羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，HEPES）緩沖液（上海信帆生物，批號(hào)：XFSJ-0087）；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（Methyl thiazolyl tetrazoliun，MTT）細(xì)胞增殖試劑盒（北京富龍康泰，批號(hào)：FP-M-300）；抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resisatnt acid phosphatase，TRAP）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0332）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 采用大鼠顱蓋骨機(jī)械法［4］體外分離培養(yǎng)獲得成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）；采用新生大鼠長干骨機(jī)械分離法［5］獲得破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）。

1.3.2 分組方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組，觀察組培養(yǎng)液為10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS+αMEM 培養(yǎng)液+高濃度扶芳藤提取物，對(duì)照組不加扶芳藤提取物。

1.3.3 促進(jìn)骨形成的實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)方法 將高濃度扶芳藤提取物（扶芳藤乙醇提取物浸膏含量為200 mg/kg）加入到 OB 細(xì)胞培養(yǎng)箱中（48 孔培養(yǎng)板，每孔加入80 μL）。采用骨鈣素免疫組化法和體外鈣化能力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行0B 的鑒定，采用MTT 比色法檢測(cè)0B 增殖。利用對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)比色法（Para-nitrophenyl phosphate，pNPP）檢測(cè)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）含量及活性。

l.3.4 抑制骨吸收的實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)方法 將高濃度扶芳藤提取物加入到OC細(xì)胞培養(yǎng)箱中（48孔培養(yǎng)板，每孔加入80 μL）。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行TRAP染色，鑒定OC并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)骨片上吸收陷窩的變化，于培養(yǎng)第7 天對(duì)陷窩進(jìn)行攝影，采用Mimics Medical 21.0 醫(yī)學(xué)圖像處理軟件分析吸收陷窩面積。采用原子分光光度計(jì)法測(cè)定OC 培養(yǎng)液上清液中鈣離子含量。

l.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用PEMS 3.2 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OB 細(xì)胞周期及ALP 含量大鼠OB 在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24、48、72 h后，觀察組與對(duì)照組相比，各時(shí)相點(diǎn)均無明顯差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，觀察組在 24、48、72 h 3 個(gè)時(shí)相點(diǎn)均能夠提高 ALP 活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 骨吸收陷窩面積及鈣離子含量加入高濃度扶芳藤提取物后，鏡下見OC發(fā)生明顯空泡性變，細(xì)胞輪廓模糊不清，TRAP著色不均勻。體外OC培養(yǎng)7 天后，觀察組骨吸收陷窩面積明顯縮小，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。體外OC培養(yǎng)7天后，觀察組培養(yǎng)液上清液中鈣離子含量下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組OB細(xì)胞周期、ALP含量及活性比較（）

表1 兩組OB細(xì)胞周期、ALP含量及活性比較（）

組別觀察組對(duì)照組例數(shù)12 12 OB細(xì)胞周期（%）ALP含量（μ/L）24 h 59.35±6.04 56.78±4.29 1.2017 0.2423 72 h 52.76±5.65 54.95±6.42 0.8871 0.3846 t P 48 h 53.48±7.08 54.62±3.76 0.5056 0.6182 24 h 29.42±3.16 18.37±2.59 9.3686 0.0000 48 h 56.33±6.03 24.62±3.48 15.7777 0.0000 72 h 68.57±8.12 28.42±4.39 15.0675 0.0000

表2 兩組骨吸收陷窩面積及鈣離子含量比較（）

表2 兩組骨吸收陷窩面積及鈣離子含量比較（）

組別觀察組對(duì)照組例數(shù)12 12 t P骨吸收陷窩的面積（um2）0天569.42±75.45 628.36±86.59 1.7777 0.0893 7天106.49±25.15 2874.62±372.44 25.6883 0.0000鈣離子含量（mg/L）0天66.72±6.39 68.31±7.24 0.5704 0.5742 7天46.05±5.47 67.62±6.85 8.5239 0.0000

3 討論

扶 芳 藤 Euonymus fortunei（Turcz）Hand-Mazz為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物［6］，屬于廣西道地藥材。扶芳藤入藥首載于《本草拾遺》：“扶芳藤，味苦，小溫，無毒，主一切血，一切氣，一切冷，去百病，久服延年，變白，不老，大主風(fēng)血”，可用于治療風(fēng)濕痹痛、腰肌勞損、吐血、血崩、創(chuàng)傷出血、月經(jīng)不調(diào)、血瘀閉經(jīng)、跌打骨折等，主要以莖葉入藥，全年可采，在廣西民間應(yīng)用十分廣泛，屬于典型的壯藥?！吨兴幋筠o典》記載：“補(bǔ)腎強(qiáng)筋，安胎，止血消瘀”“扶芳藤泡酒日服兩次，治風(fēng)濕疼痛”“扶芳藤治腰肌勞損、關(guān)節(jié)酸痛”，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用其治療腎虛腰痛、腰肌勞損、風(fēng)濕痹痛、慢性腹瀉、咯血、血崩、月經(jīng)不調(diào)、跌打骨折、創(chuàng)傷出血等?！吨袊鴫阉庂Y源名錄》中記載［7］，扶芳藤微苦，熱，通調(diào)龍路、火路，補(bǔ)氣、血虛，強(qiáng)筋骨，止血，用于嘞內(nèi)（血虛）、噓內(nèi)（氣虛）、核難（腰肌勞損）、發(fā)旺（風(fēng)濕痹痛），林得叮相（跌打損傷）、奪扼（骨折）、叮相噢嘞（創(chuàng)傷出血）、鹿嘞（吐血）、約京亂（月經(jīng)不調(diào)）、貧淋嘞（崩漏）、嘚聚綏（落枕）。

扶芳藤雖為壯藥，但是長期以來都是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下被廣泛研究。陳曦［8］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方扶芳藤合劑能在一定程度上降低骨破壞進(jìn)展，可有效減少骨小梁的斷裂，降低骨小梁間距。治療作用和劑量有一定的依賴關(guān)系，從而推論出復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)去卵巢大鼠引起的大鼠骨代謝具有積極影響。

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面均有雌激素受體，它們分別是骨形成和骨分解代謝中的主要功能細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，高濃度扶芳藤提取物可以提高成骨細(xì)胞ALP 的活性。ALP 是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)記酶，是成骨細(xì)胞分化早期的重要生物學(xué)標(biāo)志，在礦化過程中起著重要作用，是骨轉(zhuǎn)換率的重要指標(biāo)［9］。因此可以認(rèn)為扶芳藤提取物對(duì)體外骨形成具有一定的促進(jìn)作用。另一方面，高濃度扶芳藤提取物可引起體外破骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的顯著變化及骨吸收陷窩的面積降低，并引起OC 培養(yǎng)液上清液鈣離子含量的下降，表明其對(duì)體外骨吸收有一定的抑制作用。此種表現(xiàn)與雌激素的作用特點(diǎn)相符。對(duì)扶芳藤的相關(guān)研究［10-12］表明，扶芳藤中存在一系列黃酮苷類成分，且含量較高，這類黃酮苷可被作為扶芳藤藥材定量控制的指標(biāo)性成分。李恩［13］對(duì)含有植物雌激素和黃酮類的多種中藥進(jìn)行了全方復(fù)方及拆方研究，發(fā)現(xiàn)含有黃酮類成分的中藥普遍具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化作用。李晶等［14］研究證實(shí)，含有此類成分的淫羊藿總黃酮可增強(qiáng)去勢(shì)大鼠椎體的彈性，降低其脆性，具有抗骨質(zhì)疏松的作用。葉丙霖等［15］通過文獻(xiàn)總結(jié)了補(bǔ)腎活血類中藥治療絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)多種補(bǔ)腎活血中藥發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理主要依賴于其含有的類雌激素化合物以及對(duì)成骨、破骨細(xì)胞的作用。因此，讓扶芳藤提取物能發(fā)揮雌激素替代療法的作用從而防治PMOP成為一種臨床可能。

綜上所述，扶芳藤提取物可調(diào)控體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞骨代謝，但其分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。