仇曉霞，史曉敏

西北民族大學(xué)直屬附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

宮頸癌是臨床常見(jiàn)的婦科腫瘤疾病，有研究顯示Th22細(xì)胞可通過(guò)活化AKT信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，AKT 信號(hào)通路在多種腫瘤中均與腫瘤細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)［1］。通過(guò)干預(yù)這一信號(hào)通路，可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，影響癌癥進(jìn)展［2］。細(xì)胞周期蛋白 1（cell cycle protein 1，Cyclin-D1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期的一種蛋白，在正常人群中，其表達(dá)量較低或不表達(dá)［3］。有研究顯示［4］，Cyclin-D1在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)量與正常人群比較具有顯著差異，呈明顯高表達(dá)狀態(tài)。推測(cè)Cyclin-D1 蛋白可通過(guò)干擾細(xì)胞周期引發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖失控。目前臨床對(duì)宮頸癌的治療方法主要包括手術(shù)、放化療，但治療后存在較明顯的手術(shù)創(chuàng)傷性、放化療不良反應(yīng)等并發(fā)癥。尋找更有效、不良反應(yīng)更少的新治療方法一直是臨床研究治療該病的熱點(diǎn)課題。中醫(yī)認(rèn)為宮頸癌是因人正氣內(nèi)虛、免疫力降低、外邪入侵傷及胞體導(dǎo)致［5］。紫草具有活血解毒、透疹消斑等效用［6］。其有效化學(xué)成分為紫草素，已被證實(shí)在促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用［7］。本研究將紫草素作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡情況，探討紫草素對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用是否與AKT通路、Cyclin-D1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人宮頸癌海拉（Hela）細(xì)胞（上海研生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：ZKCC-X1651）；DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生物，批號(hào)：20190420）；胎牛血清（FBS）（賽默飛世爾中國(guó)，批號(hào)：20190711）；胰蛋白酶-EDTA 消化液、蛋白質(zhì)提取試劑盒（Solarbio公司，批號(hào)：20190404、20190705）；兔源 AkT 多克隆抗體、兔源磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗體、兔多克隆Cyclin-D1 抗體（LSBio，批號(hào)：20180709）；總 RNA 提取劑 Trizol（Sangon Biotech，批號(hào) ：20181227）；紫草素粉（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)：20190707）；四唑鹽（MTT）溶液（上海酶聯(lián)生物，批號(hào)：201811122）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器H3-6815-02 型5% CO2恒溫培養(yǎng)箱（Asone），UV752 型分光光度計(jì)（山東博科科學(xué)儀器有限公司），7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI），DNM-9602型酶標(biāo)儀（北京普朗醫(yī)療）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物配制 取10 mg紫草素粉，加入100 μL二甲基亞砜溶液，制成濃度為100 mg/mL的紫草素溶液，將紫草素溶液加入DMEM 培養(yǎng)液中，制成終濃度為8、16、32 μmol/L的溶液。

1.3.2 分組及給藥 將Hela 細(xì)胞接種于含有10%FBS 的 DEME 培養(yǎng)基中 ，于 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取對(duì)數(shù)期Hela 細(xì)胞，加入10 μL 胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，離心半徑：13.5 cm，1200 r/min（RCF=1350 g），離心 5 min，棄去上清液，接種于96 孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞、100 μL DMEM 培養(yǎng)液。繼續(xù)于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，將細(xì)胞分為低濃度組、中濃度組、高濃度組、空白組。各濃度組分別加入濃度為8、16、32 μmol/L的紫草素DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，空白組加入不含紫草素DEME 培養(yǎng)液，100 μL/孔，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞凋亡率 各組繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，向每組細(xì)胞內(nèi)加入 MTT 溶液 10 μL 顯色，孵育4 h 后，設(shè)置調(diào)零孔、溶媒孔、加藥孔，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每組在490 nm 處吸光度，每組重復(fù)測(cè)3 次取均值。MTT 結(jié)果中，吸光度越大，表示活細(xì)胞數(shù)量越多，計(jì)算每組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=1-（加藥孔吸光度均值-調(diào)零孔吸光度均值）/（溶媒孔吸光度均值-調(diào)零孔吸光度均值）×100%。

1.4.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各組AKT、p-AKT、細(xì)胞周期蛋白D1 信使核糖核酸（Cyclin-Dlmessenger RNA，Cyclin-D1mRNA）蛋白表達(dá)量：采用 Trizol 提取RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR 反應(yīng)條件為95℃ 30 s 預(yù)變性、95℃ 10 min 變性、95℃ 15 s 退火、60℃1 min 延伸、95℃10 min 再延伸，循環(huán) 40次。將反應(yīng)體系放入PCR 儀，定量測(cè)定目標(biāo)基因mRNA 表達(dá)量，計(jì)算△△Ct值=每組△Ct值-空白組△Ct值，以2-△△Ct值表示目標(biāo)基因mRNA量。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表達(dá)量 采用 Western Blotting 法 檢 測(cè) 各 組 AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表達(dá)量，再采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法及凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用snk-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡率48 h 時(shí)空白組最大凋亡率為（12.37±0.29）%，低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞凋亡率均隨著時(shí)間推移而升高，高濃度組在24、48、72 h凋亡率均明顯較高。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率

2.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表達(dá)量細(xì)胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表達(dá)量隨著濃度的增高而減少，高濃度組均明顯低于其他各組（P＜0.05）；中濃度組均明顯低于低濃度組及空白組（P＜0.05）；低濃度組表達(dá)量低于空白組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表達(dá)量

2.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表達(dá)量AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白量隨著濃度的增高而減少，高濃度組均明顯低于其他各組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表達(dá)量

3 討論

在婦科常見(jiàn)腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，呈逐年升高、年輕化趨勢(shì)。采用根治性手術(shù)可治療大部分早期宮頸癌患者，對(duì)于中晚期患者而言，可采用手術(shù)、放化療聯(lián)合治療，但可能出現(xiàn)多種手術(shù)并發(fā)癥、放化療不良反應(yīng)。有研究［8，17］從中藥中提取有效成分作為中藥單體，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞，取得了較好的促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。李靜等［9］發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖與大黃素對(duì)口腔癌細(xì)胞有明顯抑制作用。馬程遙等［10］研究表明番茄枝內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞有抑制作用。譚大清等［11］研究表示藤黃酸對(duì)膀胱癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。

根據(jù)中醫(yī)對(duì)宮頸癌的癥狀及已有文獻(xiàn)記載的治療方法，本研究選取了中藥紫草的中藥單體作為抗腫瘤藥物。紫草味甘、性寒，臨床常用于治療濕疹、紫癜、血尿、燒傷、黃疸［12-13］等。本研究在前期細(xì)胞增殖凋亡實(shí)驗(yàn)中，已顯示出不同濃度紫草素細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela 的增殖均有抑制作用，且這一抑制作用具有濃度依賴性，在作用24 h 后，高濃度組即可表現(xiàn)出較高的促腫瘤細(xì)胞凋亡率。但由于本研究設(shè)置組別有限，未能就多種不同梯度的紫草素濃度對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行分析，也未能得到最佳抑制濃度。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中，還需進(jìn)一步對(duì)紫草素抑制Hela 細(xì)胞的最佳濃度進(jìn)行探究。

紫草素對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有較好的抑制作用被證實(shí)后，進(jìn)一步分析宮頸癌發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)紫草素的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用可能與常見(jiàn)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖AKT 信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白有關(guān)。通過(guò)對(duì)不同濃度紫草素作用后Hela細(xì)胞AKT、pAKT表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)空白組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白均高表達(dá)，低濃度、中濃度組及高濃度組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白較空白組明顯降低，且降低幅度隨濃度升高而增大，高濃度組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白表現(xiàn)出明顯低表達(dá)。AKT 信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞重要的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，被活化的AKT 可增加核轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)激活基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，便于腫瘤細(xì)胞增殖侵襲［14］。因此本研究結(jié)果提示紫草素可通過(guò)抑制AKT 信號(hào)通路的促腫瘤細(xì)胞增殖作用，達(dá)到抑制腫瘤的目的。同時(shí)，不同組細(xì)胞的Cyclin-D1 mRNA及蛋白表達(dá)量分析結(jié)果顯示與AKT 表達(dá)結(jié)果相似，Cyclin-D1 mRNA及蛋白表達(dá)量在被紫草素作用后的各組Hela 細(xì)胞中均明顯降低。表明紫草素對(duì)Cyclin-D1 蛋白也具有抑制作用。Cyclin-D1 在細(xì)胞周期中，可與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期，進(jìn)而使細(xì)胞分化增殖［15-17］。正常狀態(tài)下Cyclin-D1 表達(dá)量處于穩(wěn)定狀態(tài)，過(guò)表達(dá)的Cyclin-D1會(huì)使細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞不斷從G1期進(jìn)入S 期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖分化速度加快。本研究結(jié)果還表明紫草素可通過(guò)抑制Cyclin-D1表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，紫草素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞具有明顯抑制增殖作用，且這一作用呈濃度依賴性。紫草素對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)抑制ATK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Cyclin-D1 蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。