王 龍，馬 磊，黃 燕，張 勇，席紅娜，呂建瑞

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI）多見(jiàn)于冠心病、心肌梗死以及冠狀動(dòng)脈介入治療的患者，是指心肌在受到較長(zhǎng)時(shí)間缺血后，當(dāng)血液再恢復(fù)灌注時(shí)給心肌帶來(lái)的病理性組織損害，這種損害包括直接的病理性組織損傷、心臟功能下降及心臟代謝障礙等，嚴(yán)重者可致患者死亡［1-2］。目前 MI/RI 的發(fā)生機(jī)制還沒(méi)有完全明確，治療原則主要以預(yù)防為主［3］。中醫(yī)藥在預(yù)防本病中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括一些中藥湯劑和中藥提取物在本病的預(yù)防治療方面有許多文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］。楊梅素即是其中之一，國(guó)內(nèi)學(xué)者邵玲等［6］研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素對(duì)MI/RI大鼠具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)理與楊梅素可調(diào)節(jié)PI3K、AKT 和 mTOR 蛋白表達(dá)有關(guān)。此外還有研究［7］觀察了楊梅素對(duì)離體MI/RI 大鼠模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊梅素對(duì)其也有很好的調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)理是通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ/NF-κB 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，但是目前的研究還沒(méi)有心肌血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的研究報(bào)道，因此本研究采用楊梅素干預(yù)大鼠，觀察大鼠發(fā)生MI/RI 后HO-1 蛋白及mRNA 的表達(dá)特點(diǎn)，以豐富楊梅素預(yù)防治療MI/RI的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇72 只健康雄性SD 大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK 2015-001。飼養(yǎng)條件：大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，由專業(yè)人員按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)［8］飼養(yǎng)，在購(gòu)買后先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑楊梅素（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)：529-44-2）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)分別為：CSB-E08556m、CSB-E05840h、CSB-E04639m和CSB-E09315h）；總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：BC3790）；總RNA 提取試劑盒（北京天根生物試劑有限公司，批號(hào)：DP419），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)：A3500）；兔抗大鼠血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和甘油三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國(guó) Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為：sc-1796 和 sc-59540）；辣根酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZB-2306）；引物（武漢谷歌生物設(shè)計(jì)并生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將72 只健康雄性SD大鼠分為假手術(shù)組（生理鹽水1.0 mL/kg灌胃），模型組（生理鹽水1.0 mL/kg灌胃），陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林10 mg/kg灌胃），楊梅素高（楊梅素400 mg/kg 灌胃）、中（楊梅素 200 mg/kg 灌胃）、低（楊梅素100 mg/kg 灌胃）劑量組，每組12 只。給藥劑量根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［9］確定，給藥2周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 模型制備 大鼠MI/RI模型根據(jù)文獻(xiàn)［10］報(bào)道的方法進(jìn)行制備，大鼠禁食不禁水12 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，后將其固定，行氣管插管，同時(shí)用心電圖記錄儀記錄大鼠心電圖，找到第四根肋骨后剪斷，剪開(kāi)心包，暴露心臟，剝離心包膜后于左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎，后進(jìn)行常規(guī)缺血再灌注損傷手術(shù)，而假手術(shù)組只給予穿線但不結(jié)扎。造模成功的標(biāo)志為，大鼠心臟下部心肌組織顏色發(fā)白，同時(shí)心電圖有明顯ST 段抬高（缺血30 min，再灌注120 min）。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 組織學(xué)觀察 1）實(shí)驗(yàn)完成后，采用腹主動(dòng)脈取血法采集大鼠血液，血液收集后使用低溫高速離心機(jī)離心（4℃，離心半徑4 cm，4000 r/min，離心10 min），離心后收集血漿，將其置入超低溫冰箱中用于相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)。血液收集后采集心臟組織，將其分成三部分：其中一部分置入組織固定液中用于相關(guān)病理學(xué)檢測(cè)，一部分置入超低溫冰箱中用于蛋白和mRNA 的檢測(cè)，剩余一部分置入-20℃冰箱中用于心臟相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)。2）從組織固定液中取出心臟組織，根據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道方法，采用HE 染色檢測(cè)心肌組織病理學(xué)，檢測(cè)完成后采用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)變化特點(diǎn)，每張切片均選取4個(gè)不同視野。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 1）采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組血液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量。2）采用酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠心臟中SOD、MDA、IL-6 和 TNF-α 含量。3）采用 Western blot測(cè)定心肌組織HO-1 蛋白表達(dá)，從超低溫冰箱中取出心臟組織，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白后并測(cè)定蛋白含量，后將其統(tǒng)一調(diào)平，完成后每組各取50 μg 行SDS-PAGE 電泳分離，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h 后洗滌 3 次，后加入一抗封閉（HO-1 抗體（1∶1500），GAPDH 抗體（1∶3000））過(guò)夜，次日取出后采用TBST洗滌 3 次，加入 2 抗（1∶3000）40 min 后，洗滌 3 次，采用增強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒對(duì)其進(jìn)行顯影，后掃描膜，采用圖像分析軟件分析每個(gè)蛋白積分光密度值（IOD），結(jié)果以 HO-1 的 IOD 值與 GAPDH 條帶的IOD 值的比值作為HO-1 的相對(duì)表達(dá)量。4）采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)心肌組織HO-1 mRNA 表達(dá)，從超低溫冰箱中取出心臟組織，按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)用總RNA 提取試劑盒提取各組大鼠心肌組織總RNA，完成后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，后每組各取 2 μg 行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃ 2 min、94℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 40 s，循環(huán)次數(shù)34 次。引物序列：HO-1，上游序列：5'-AGCCCCACCAAGTTCAAACA-3'，下游序列：5'-TGCCAACA GGAAGCTGAGAG-3'，擴(kuò)增片斷 321 bp。GAPDH，上游序列：5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游序列：5'-CCACAGGATTCCATACCCAA-3'，擴(kuò)增片段446 bp，分析方法為2-ΔΔCt法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LDH和CK活性與假手術(shù)組比較，模型組血清LDH和CK水平均明顯升高（P＜0.05）；相較于模型組，陽(yáng)性對(duì)照組和楊梅素各劑量組LDH、CK 水平均明顯降低（P＜0.05），其中以楊梅素高劑量組明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌酶LDH和CK水平比較（） U/L

表1 各組大鼠心肌酶LDH和CK水平比較（） U/L

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組CK 640.18±80.21 1613.51±178.16*1264.72±160.40*#1328.14±110.27*#1179.35±123.47*#983.24±98.15*#△鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 LDH 1138.36±98.27 4950.26±442.18*3183.21±408.29*#3279.16±275.31*#3085.26±298.15*#2641.19±273.28*#△

2.2 心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中MDA、IL-6和TNF-α水平顯著提高，SOD水平下降（P＜0.05），與模型組比較，楊梅素各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組MDA、IL-6 和 TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 水平明顯升高（P＜0.05），此外楊梅素高劑量組MDA、IL-6和TNF-α水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），SOD水平明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平比較（）

表2 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平比較（）

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組TNF-α（pg/mg）20.15±6.43 56.68±14.65*39.71±11.18*#40.25±13.26*#37.68±12.17*#34.26±9.35*#△鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 SOD（U/mg）88.47±10.18 21.35±14.18*64.39±17.21*#64.57±14.36*#68.24±13.18*#74.82±13.28*#△MDA（nmol/mg）0.46±0.15 3.92±0.56*1.27±0.34*#1.39±0.31*#118±0.27*#0.98±0.28*#△IL-6（pg/mg）24.80±6.21 73.46±18.33*46.18±10.28*#45.36±12.47*#42.84±9.35*#39.71±10.58*#△

2.3 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠心肌組織病理學(xué)可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌纖維形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組出現(xiàn)明顯病理變化，主要表現(xiàn)為心肌纖維斷裂，結(jié)構(gòu)稀疏；與模型組相比，楊梅素低劑量、中劑量和高劑量組逐漸好轉(zhuǎn)，特別是楊梅素高劑量組僅有少量的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變性。此外楊梅素高劑量組心肌組織形態(tài)也明顯好于陽(yáng)性對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 心肌組織染色結(jié)果（HE×400）

2.4 心肌組織HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)各組大鼠心肌組織中HO-1蛋白及mRNA表達(dá)，與假手術(shù)組比較，HO-1 蛋白模型組有一定升高（P＜0.05），與模型組比較，楊梅素各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)一步升高（P＜0.05），但楊梅素各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 心肌組織中HO-1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠心肌HO-1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量（） mmol/L

表3 各組大鼠心肌HO-1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量（） mmol/L

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

HO-1 mRNA表達(dá)1.01±0.01 1.26±0.16*2.08±0.24*#1.96±0.19*#2.03±0.22*#2.19±0.18*#組別/指標(biāo)假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 HO-1蛋白表達(dá)0.67±0.11 0.74±0.12*1.47±0.18*#1.45±0.12*#1.43±0.14*#1.50±0.11*#

3 討論

MI/RI 危害極大，近年來(lái)大量流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者在發(fā)生MI/RI后，約有10%的患者發(fā)生死亡，心功能不全的患者M(jìn)I/RI 發(fā)生后死亡率高達(dá)25%，即使是已經(jīng)進(jìn)行手術(shù)的心肌梗死患者，也有2%～3%的患者死于MI/RI，25%的患者雖然不會(huì)死亡，但再灌注后會(huì)引起不同程度的心率失常、低血壓甚至心功能不全等并發(fā)癥，給患者帶來(lái)極大的損害［10-14］。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，溶栓治療和冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)廣泛推廣，上述治療雖然可以極大減少心肌缺血時(shí)間，但對(duì)心肌的損傷依然存在，因此開(kāi)發(fā)藥物盡可能減少M(fèi)I/RI是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［15］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)多種黃酮類化合物對(duì)治療MI/RI 有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。劉丹等［16］構(gòu)建了MI/RI動(dòng)物模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regu-lated protein78，GRP78）表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心肌組織。此外，梁麗梅等［17］研究發(fā)現(xiàn)龍血竭總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化能力保護(hù)MI/RI 大鼠心肌損傷。楊梅素也是黃酮類化合物之一，其對(duì)心肌的保護(hù)作用已有文獻(xiàn)報(bào)道，本次研究進(jìn)一步明確楊梅素保護(hù)MI/RI機(jī)理。研究中首先構(gòu)建了MI/RI大鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組心肌細(xì)胞明顯斷裂，心肌有一定的炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)心肌酶LDH 和CK 明顯升高，這提示本次研究模型成功構(gòu)建，而使用楊梅素治療后，LDH 和CK 明顯降低，心肌組織病理學(xué)也明顯好轉(zhuǎn)，這證實(shí)了楊梅素確實(shí)可以很好地預(yù)防MI/RI大鼠心肌損害。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 蛋白具有明顯提高抗氧化能力的作用，HO-1 是體內(nèi)的一種常見(jiàn)的抗氧化調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)節(jié)作用可能是因?yàn)镠O-1 可以氧化分解體內(nèi)的血紅素，而血紅素可分解形成膽紅素，膽紅素則具有明顯的抗氧化作用［18］。關(guān)于其抗氧化作用的研究，如國(guó)外學(xué)者Turkseven 等［19］構(gòu)建了糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)直接誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可以提高體內(nèi)多種抗氧化指標(biāo)，包括SOD、內(nèi)皮型一氧化氮及過(guò)氧化氫酶的表達(dá)，同時(shí)降低MDA 的含量，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中抗氧化指標(biāo)SOD 明顯增加，MDA 明顯降低，這提示MI/RI 大鼠的抗氧化能力明顯降低，而楊梅素則可以明顯地提高SOD 活性，同時(shí)降低MDA 活性，且楊梅素高劑量組明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，這提示楊梅素對(duì)MI/RI 大鼠心肌組織中抗氧化能力的提高具有明顯的促進(jìn)作用。

此外近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 也具有強(qiáng)大的抗炎能力［20］。正常情況下，在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷后，心肌細(xì)胞可以釋放出過(guò)多的血紅素，其分泌的血紅素主要有兩個(gè)作用，一方面誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，另一方面則可以反饋調(diào)節(jié)，誘發(fā)心肌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)。HO-1在過(guò)量表達(dá)后，可以通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞黏附、趨化和滲透，進(jìn)而發(fā)揮一定的抗氧化作用。如Kapturczak等［21］研究發(fā)現(xiàn)，基因剔除的HO-1 小鼠血清中IgM水平會(huì)明顯增高，給予這些小鼠使用脂多糖刺激后，小鼠可釋放出高水平的IL-1、IL-6 和TNF-α等，而正常的小鼠則沒(méi)有這種反應(yīng)，這提示HO-1基因剔除的小鼠抗炎能力明顯降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中IL-6 和 TNF-α 明顯升高，這提示 MI/RI 大鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)，而采用楊梅素治療后，大鼠IL-6和TNF-α 明顯降低，這提示楊梅素對(duì)炎癥反應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)結(jié)合HO-1 蛋白及mRNA的表達(dá)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，楊梅素可以明顯提高心肌組織中HO-1蛋白及mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)這種表達(dá)的變化特點(diǎn)與抗氧化指標(biāo)SOD和MDA、炎性因子指標(biāo)IL-6 和TNF-α 的變化特點(diǎn)具有一致性，這提示，楊梅素抗MI/RI 大鼠炎癥反應(yīng)，同時(shí)提高抗氧化能力可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心肌組織中HO-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，楊梅素對(duì)MI/RI 大鼠心肌損傷具有明顯的抑制作用，其保護(hù)作用機(jī)理是通過(guò)提高心肌中HO-1蛋白及mRNA的表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥因子IL-6 和TNF-α，提高抗氧化指標(biāo)SOD，降低氧化產(chǎn)物MDA實(shí)現(xiàn)的。