楊艷玲，張晶，覃元

慢性腹瀉是指病程在兩個(gè)月以上的腹瀉或間歇期在2～4周內(nèi)的復(fù)發(fā)性腹瀉，病因較為復(fù)雜，病程遷延。根據(jù)病因不同，臨床癥狀多樣化，治療原則各異。據(jù)報(bào)道，慢性腹瀉是五歲以下兒童中第三大死亡原因，每年導(dǎo)致超過300萬人死亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，飲食、心理、基因、環(huán)境、壓力和炎癥等多種因素均與慢性腹瀉有關(guān)[3]。這些因素可能會(huì)改變腸腦軸，誘發(fā)胃腸道蠕動(dòng)異常或損害腸黏膜屏障功能，隨后導(dǎo)致相關(guān)的腹瀉癥狀[4]。

最近的研究表明，炎癥可能在慢性腹瀉的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[5-6]。炎性細(xì)胞因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α?xí)绊懩c胃蠕動(dòng)、分泌和重吸收。此外，IL-1β和TNF-α可以增加慢性腹瀉患者的腸道敏感性[7]。因此，找到這些炎癥因子異常表達(dá)的機(jī)制肯定會(huì)使慢性腹瀉患者受益。

眾所周知，TLR4/NF-κB通路在炎癥反應(yīng)中起重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性腸綜合征的小腸黏膜中的主要黏膜受體，TLRs家族成員(TLR4、TLR5和TLR9)被上調(diào)[9]。此外，TLR4可以激活關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)NF-κB來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8,10]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路在慢性腹瀉中研究甚少，因此需要進(jìn)一步的研究。

大蒜素(Allicin)是從蔥科蔥屬植物大蒜(Allium Sativum)的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物，也存在于洋蔥和其他蔥科植物中，學(xué)名二烯丙基硫代亞磺酸酯。研究表明，大蒜素具有消炎、降血壓、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[11]。因此，我們對(duì)大蒜素是否可以在慢性腹瀉中對(duì)腸黏膜有保護(hù)作用及發(fā)揮抗炎作用產(chǎn)生了興趣。

本文試圖研究大蒜素是否通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)慢性腹瀉有改善作用，對(duì)炎癥因子有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只Wistar大鼠(雄性，體質(zhì)量180±20 g)購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房。大鼠經(jīng)一周適應(yīng)環(huán)境，正常飲水飲食。

1.1.2 試劑 大蒜素(純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。蘇木精-伊紅(HE)、DAB和免疫組化試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。兔抗p-TLR4抗體(貨號(hào)：1387S；批號(hào)：20190234)、兔抗TLR4抗體(貨號(hào)：14358S；批號(hào)：20190145)、兔抗p-NF-κB p65抗體(貨號(hào)：8214S；批號(hào)：20200112)、兔抗NF-κB p65抗體(貨號(hào)：8242S；批號(hào)：20194578)、兔抗β-actin抗體(貨號(hào)：4970S；批號(hào)：20200178)和山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：2985S；批號(hào)：20190823)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 建立慢性腹瀉大鼠模型[12]：Wistar大鼠均以含生藥1 g/mL生大黃水煎劑按0.02 mL/g 劑量灌胃，每日1次，連續(xù)8 d，造成慢性腹瀉模型。每只大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，以排便量和濕糞率作為腹瀉的指標(biāo)。濕糞率：每天通過濾紙印記計(jì)算濕糞率，確定24 h內(nèi)排便的總數(shù)以及濕糞的數(shù)量，濕糞率=濕糞數(shù)量/排便總數(shù)×100%。灌胃給藥8 d后，造模各組大鼠排便量和濕糞率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，表明造模成功。

1.2.2 分組及給藥

(1)分組：Wistar大鼠分為空白對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、大蒜素低劑量組(A-L組)、大蒜素高劑量組(A-H組)，每組15只。C組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，M組、A-L組、A-H組按第1.2.1小節(jié)進(jìn)行相應(yīng)劑量的灌胃。

(2)給藥：給藥方式為灌胃。C組：無菌生理鹽水，20 mL/kg；M組：無菌生理鹽水，20 mL/kg；A-L組：30 mg/kg的大蒜素；A-H組：50 mg/kg的大蒜素[13]。每天給藥一次，連續(xù)2周。

1.2.3 血漿內(nèi)毒素水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血，并置于肝素抗凝試管內(nèi)，3 000 rpm/min 離心15 min，吸取上層血漿，按照用ELISA試劑盒說明書測(cè)定血漿中內(nèi)毒素水平。

1.2.4 血清炎癥因子水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血，并置于EP管內(nèi)，3 000 rpm/min 離心15 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔的光密度(OD值)，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量。

1.2.5 HE檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織病理變化 切取各組大鼠結(jié)腸組織，經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋，制成5 μm的切片。切片放入蘇木素溶液中5 min，自來水清洗。切片放入伊紅染液中染色 3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精(70%、80%、90%、100%)中脫水，各5 min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，各5 min。將切片取出，風(fēng)干，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)大鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量 各組大鼠糞便樣品中的基因組DNA用基因組DNA提取試劑盒，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各組樣品中DNA含量，并將每個(gè)配對(duì)的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。擴(kuò)增：95 ℃，30 s；變性：95 ℃，40 s；退火：在不同的溫度下循環(huán)40 s (雙歧桿菌55 ℃，乳酸桿菌50 ℃，大腸桿菌52 ℃)。使用FTC-3000p實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。其中使用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65的磷酸化程度 RIPA裂解液提取各組大鼠的結(jié)腸組織(100 mg)中的總蛋白，BCA法進(jìn)行定量，樣品經(jīng)變性后進(jìn)行上樣。按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育[p-TLR4抗體(1∶2 000)、TLR4抗體(1∶2 000)、p-NF-κB p65抗體(1∶2 000)、NF-κB p65抗體(1∶2 000)和β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜]-二抗孵育[IgG抗體(1∶5 000)，室溫1.5 h]-顯影曝光。Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)各組大鼠狀態(tài)及體質(zhì)量的影響

造模期間，C組大鼠反應(yīng)靈活、主動(dòng)覓食、頻繁活動(dòng)、大便成形、體質(zhì)量增加； M組、A-L組、A-H組大鼠在造模第2天就出現(xiàn)稀便，之后病情逐漸加重，體質(zhì)量也慢慢減輕，飲食減少、少動(dòng)、消瘦，但是有自愈的傾向。給藥期間，C組大鼠依舊反應(yīng)靈活、主動(dòng)覓食、頻繁活動(dòng)、大便成形、體質(zhì)量不斷增長(zhǎng)；M組大鼠有自愈的傾向，稀便次數(shù)有所減少，體質(zhì)量有所增加；A-L組和A-H組大鼠隨著藥物的治療，體質(zhì)量不斷增加，稀便次數(shù)減少。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 大蒜素對(duì)各組大鼠排便量和濕糞率的影響

如圖1所示，C組、M組、A-L組、A-H組大鼠排便量和濕糞率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.54，P<0.001；F=62.54，P<0.001)。與C組比較，M組大鼠排便量和濕糞率顯著升高(均P<0.001)；與M組比較，A-L組大鼠排便量和濕糞率下降(均P<0.05)，A-H組大鼠排便量和濕糞率下降(均P<0.01)，且隨著大蒜素劑量增加，效果越明顯。

圖1 各組大鼠的排便量和濕糞率 A：各組大鼠排便量的比較；B：各組大鼠濕糞率的比較。與C組比較，***P<0.001；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 大蒜素對(duì)各組大鼠血漿中內(nèi)毒素表達(dá)水平的影響

如圖2所示，C組、M組、A-L組、A-H組大鼠血漿中內(nèi)毒素表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.04，P<0.001)。與C組比較，M組大鼠血漿內(nèi)毒素表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.001)；與M組比較，A-L組和A-H組大鼠血漿內(nèi)毒素表達(dá)水平下降(P<0.05，P<0.01)，且隨著大蒜素劑量增加，血漿內(nèi)毒素水平下降越明顯。

圖2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素表達(dá)水平 與C組比較，***P<0.001；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 大蒜素對(duì)各組大鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響

如圖3所示，C組、M組、A-L組、A-H組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.56，P<0.001；F=28.11，P<0.001；F=36.32，P<0.001；F=55.72，P<0.001)。與C組比較，M組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著上調(diào)(均P<0.001)，IL-10的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.001)；與M組比較，A-L組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.05)，IL-10的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；與M組比較，A-H組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.01)，IL-10的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)；且隨著大蒜素劑量增加，效果越明顯。

2.5 大蒜素對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖4所示，HE染色結(jié)果顯示，C組大鼠結(jié)腸組織有完整的上皮和黏膜，隱窩結(jié)構(gòu)無破壞；與C組比較，M組大鼠結(jié)腸組織的上皮和黏膜被嚴(yán)重破壞，隱窩結(jié)構(gòu)也有破壞；與M組比較，A-L和A-H組大鼠結(jié)腸組織的上皮和黏膜有所修復(fù)，隱窩結(jié)構(gòu)也能較清楚的看見，且與劑量呈正比。

2.5 大蒜素對(duì)各組大鼠腸道菌群相對(duì)數(shù)量的影響

如圖5所示，C組、M組、A-L組、A-H組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.02，P<0.001；F=68.90，P<0.001；F=24.27，P<0.01)。與C組比較，M組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量顯著減少(均P<0.001)，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量明顯增加(P<0.01)；與M組比較，A-L組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量增加(均P<0.05)，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量減少(P<0.05)；與M組比較， A-H組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量增加(均P<0.01)，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。

圖3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的表達(dá)水平 A：各組大鼠血清中TNF-α表達(dá)水平的比較；B：各組大鼠血清中IL-1β表達(dá)水平的比較；C：各組大鼠血清中IL-6表達(dá)水平的比較；D：各組大鼠血清中IL-10表達(dá)水平的比較。與C組比較，***P<0.001；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化(HE,×200)

2.6 大蒜素對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，C組、M組、A-L組、A-H組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.06，P<0.001；F=45.28，P<0.001)。與C組比較，M組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(均P<0.001)；與M組比較，A-L組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)；與M組比較， A-H組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.01)，且呈劑量依賴性。

圖5 各組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量 A：各組大鼠腸道中雙歧桿菌的相對(duì)數(shù)量比較；B：各組大鼠腸道中乳酸桿菌相對(duì)數(shù)量的比較；C：各組大鼠腸道中大腸桿菌相對(duì)數(shù)量的比較。與C組比較，**P<0.01，***P<0.001；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 A：各組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)圖；B：各組大鼠結(jié)腸組織中p-TLR4蛋白表達(dá)水平比較；C：各組大鼠結(jié)腸組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較。與C組比較，***P<0.001；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3 討論

慢性腹瀉是全球重大的健康問題，其高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，造成患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[14-15]。慢性腹瀉的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究表明其可能與腸道動(dòng)力、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)異常等密切相關(guān)，其中炎性反應(yīng)是慢性腹瀉的重要發(fā)病機(jī)制[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性腹瀉的大鼠腸黏膜結(jié)夠發(fā)生變化，血清中炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)的表達(dá)水平發(fā)生變化，與上述報(bào)道一致。

眾所周知，TLR屬于模式識(shí)別受體，是先天免疫系統(tǒng)的組成部分[18]。TLR4能夠通過MyD88依賴性途徑激活NF-κB。NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其可以在應(yīng)激環(huán)境中被激活[19-20]。研究表明，NF-κB是炎癥相關(guān)的疾病如神經(jīng)退行性疾病和糖尿病的可行治療靶標(biāo)[21-22]。因此，抑制NF-κB可以有效阻斷炎癥途徑。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠造成慢性腹瀉模型后，血清中炎癥因子的表達(dá)發(fā)生變化，結(jié)腸組織中TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，因此，通過抑制NF-κB的激活，可改善腹瀉和黏膜微結(jié)構(gòu)等癥狀。

腸道是體內(nèi)最大的細(xì)菌庫(kù)，腸黏膜屏障的損傷可使腸道的微生物、內(nèi)毒素侵入腸外組織。研究表明，腸道微生物群改變?cè)诼愿篂a的病理生理中具有重要作用[23]。頻繁腹瀉會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。腸道中有三種常見的微生物群：雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌。血清內(nèi)毒素的水平在一定程度上可以反映腸黏膜屏障的完整性，也可以對(duì)藥物的治療進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血漿內(nèi)毒素水平顯著上調(diào)，雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量顯著減少，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量明顯增加。

大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物，也存在于洋蔥和其他蔥屬植物中[24]。大蒜素具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，對(duì)多種球菌、桿菌、真菌、病毒等均有抑制或殺滅作用[25-26]。本實(shí)驗(yàn)中，大蒜素明顯改善了慢性腹瀉的癥狀，慢性腹瀉大鼠排便量和濕糞率下降、結(jié)腸黏膜組織有所修復(fù)、血清中炎性因子表達(dá)發(fā)生變化、TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)水平下降。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB途徑與慢性腹瀉之間存在相關(guān)性，NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。大蒜素可抑制了TLR4/NF-κB通路的激活并調(diào)節(jié)大鼠的血清中炎癥因子的表達(dá)，從而改善慢性腹瀉的病程。