滕衛(wèi)麗，鄭立娜，張 琦，趙 雪，韓英鵬，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

大豆（Glycine maxL.）起源于中國，種植歷史悠久，其種子富含植物蛋白質(zhì)和油脂，是世界上重要糧油兼?zhèn)渥魑颷1]。近年來，轉(zhuǎn)基因大豆種植面積逐年增加，是目前為止全球種植面積最大[2-3]、商業(yè)化程度最高的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[4]，主要栽培于美國、巴西、阿根廷、加拿大和印度[5]。轉(zhuǎn)基因大豆種植提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，加快轉(zhuǎn)基因育種步伐[6]。我國大豆產(chǎn)業(yè)存在單產(chǎn)偏低、種植成本偏高等現(xiàn)象，現(xiàn)已成為世界最大大豆消費(fèi)國和進(jìn)口國[7]。加快國內(nèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究對(duì)于改變大豆產(chǎn)業(yè)被動(dòng)局面具有重要意義。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因通過生物技術(shù)導(dǎo)入受體植物基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，產(chǎn)生抗病蟲、抗除草劑、抗逆、高產(chǎn)、營養(yǎng)品質(zhì)改良等滿足人類需求的技術(shù)[8]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比于傳統(tǒng)育種技術(shù)，打破物種間生殖隔離，促進(jìn)不同物種間遺傳物質(zhì)交流，降低不良突變效率[9]。大豆相較于玉米和水稻遺傳轉(zhuǎn)化效率較低[10]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)關(guān)鍵在于外源基因穩(wěn)定高效導(dǎo)入受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出完整植株。建立高效穩(wěn)定大豆再生體系是開展大豆遺傳轉(zhuǎn)化的前提[11]。大豆基因型較大程度上決定大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率，不同基因型之間農(nóng)桿菌易感性和組織培養(yǎng)再生率存在顯著差異[12]，提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率和再生效率關(guān)鍵在于篩選再生能力較強(qiáng)基因型。

王立平等綜合國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，器官發(fā)生再生系統(tǒng)和胚狀體再生系統(tǒng)等主要遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率對(duì)大豆基因型具有較高依賴性[3]。翟銳等以17 個(gè)大豆品種作為易感基因型和高再生基因型篩選對(duì)象，結(jié)果表明TL-1 極顯著優(yōu)于其他基因型，Williams 82、HC-6、HC-3次之[13]。李文霞等以11 個(gè)大豆品種為材料研究基因型對(duì)農(nóng)桿菌敏感度，結(jié)果表明，黑農(nóng)35是最易感大豆基因型，其次為綏農(nóng)14和合豐35，易感性最差品種是黑農(nóng)44[14]。李思楠等以再生能力較好的東農(nóng)50 在2，4-D 濃度為4 mg·L-1時(shí)再生率最高[15]。張偉偉等將抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因HhERF轉(zhuǎn)入再生能力強(qiáng)百脈根中分析抗逆能力，篩選獲得抗性百脈根植株96 株，轉(zhuǎn)化率達(dá)到24%[16]。

本研究利用高再生率大豆品種合豐25 和低再生率大豆品系L-28及其衍生重組自交系群體（RIL）100個(gè)家系作為試驗(yàn)材料，評(píng)價(jià)其再生率并作QTL定位分析，為探索大豆再生規(guī)律、提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率、加快培育轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用當(dāng)?shù)仄贩N合豐25和L-28衍生重組自交系群體100個(gè)家系。

1.2 再生試驗(yàn)方法

1.2.1 種子滅菌及萌發(fā)

挑選顆粒完整且飽滿、健康無病無斑、成熟干燥種子單層平鋪于玻璃培養(yǎng)皿中，75%乙醇擦拭種皮表面，再將培養(yǎng)皿置于干燥器中（通風(fēng)櫥中完成），將1 個(gè)裝有96 mL 次氯酸鈉錐形瓶置于靠近干燥器內(nèi)壁位置，加蓋但保留縫隙，向錐形瓶中加入6 mL 濃鹽酸，迅速蓋嚴(yán)干燥器，滅菌16 h后，打開干燥器，蓋好培養(yǎng)皿。

將滅菌后大豆種子在超凈臺(tái)中打開，風(fēng)干30 min。取出接種到GM 萌發(fā)培養(yǎng)基，萌發(fā)5～6 d，直至種子發(fā)芽變綠。

1.2.2 外植體制備

將發(fā)芽大豆去掉種皮，切除多余下胚軸部分，保留全部子葉和2～3 mm下胚軸，在兩片子葉沿中線縱向切開，且平分下胚軸，去子葉節(jié)點(diǎn)部位殘留大芽，刮掉側(cè)芽（見圖1）。

圖1 外植體制備Fig.1 Preparation of explants

1.2.3 叢生芽誘導(dǎo)

將子葉節(jié)接種在SSIM-恢復(fù)固體培養(yǎng)基中，經(jīng)（25±1）℃，16 h/8 h培養(yǎng)13～15 d，誘導(dǎo)叢生芽，統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率。

1.2.4 伸長芽誘導(dǎo)

切除外植體子葉，刮掉不定芽上多余培養(yǎng)基，并切除叢生芽上誘導(dǎo)出的莖葉，僅留下誘導(dǎo)的一簇小芽，插入SEM伸長培養(yǎng)基中。

每隔14 d 繼代1 次，每次繼代均制備新的傷口，以便叢生芽更好吸收培養(yǎng)基中養(yǎng)分，接種至伸長培養(yǎng)基28 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽伸長率。

1.2.5 生根與移栽

伸長出枝條長至3～5 cm 時(shí)，切下伸長出枝條，轉(zhuǎn)移至RM生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根。長出2～3條主根后，去除培養(yǎng)基，在三角瓶中加入自來水（水面在根上方）煉苗2～3 d，移栽到草炭土與蛭石為1∶1花盆。

1.2.6 大豆子葉節(jié)法再生體系過程

大豆子葉節(jié)法再生體系過程如圖2所示。

1.2.7 培養(yǎng)基組成

外植體在組織培養(yǎng)各階段所需培養(yǎng)基成分如表1所示。

圖2 子葉節(jié)法評(píng)價(jià)再生率流程Fig.2 Flow chart of cotyledon section method for regeneration in soybean

表1 培養(yǎng)基組成Table 1 Composition of the medium

1.2.8 再生率計(jì)算方法

每個(gè)試驗(yàn)品種每個(gè)處理40個(gè)外植體，3次重復(fù)。

不定芽誘導(dǎo)率（%）=出芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

不定芽伸長率（%）=芽長大于2 cm 外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

不定芽生根率（%）=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

不定芽成苗率（%）=成苗外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析大豆RIL群體再生評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4 QTL分析

利用IciMapping 4.0 軟件中完備區(qū)間作圖法（ICIM）分析大豆RIL群體4個(gè)再生性狀QTL定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆RIL群體再生率評(píng)價(jià)

2.1.1 RIL群體再生性狀方差分析

對(duì)高再生率大豆品種合豐25 與低再生率大豆品系L-28雜交衍生重組自交系群體100份家系4個(gè)再生性狀作方差分析（見表2）。結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)率、伸長率、生根率和成苗率P值均小于0.01，即4個(gè)再生性狀均達(dá)極顯著，說明該性狀在RIL群體不同家系間存在顯著差異，不同大豆家系間再生率差異較大。

2.1.2 RIL群體再生性狀相關(guān)性分析

分析大豆RIL 群體4 個(gè)再生性狀相關(guān)性（見表3）。結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)率與伸長率、生根率和成苗率呈極顯著正相關(guān)，伸長率與生根率和成苗率呈極顯著正相關(guān)，生根率與成苗率呈極顯著正相關(guān)。

表2 大豆RIL群體4個(gè)再生性狀方差分析Table 2 Variance analysis of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

表3 大豆RIL群體4個(gè)再生性狀相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

2.1.3 大豆再生性狀分布特點(diǎn)

本研究分析大豆RIL群體100個(gè)家系叢生芽誘導(dǎo)率、伸長率、生根率和成苗率分布特點(diǎn)（見圖3）。大豆叢生芽誘導(dǎo)率為22.41%～96.67% ，其中誘導(dǎo)率50%以上家系占66%，誘導(dǎo)率90%以上和30% 以下家系較少，分別占3%和2%，說明大部分家系再生誘導(dǎo)率較高，但無法用單一指標(biāo)評(píng)價(jià)大豆家系再生能力。

大豆伸長率為0～93.33%，其中0～40%家系占62%；伸長率90%以上和10%以下家系較少，分別占1%和4%。說明大部分家系伸長率較低，可與誘導(dǎo)率結(jié)合篩選大豆再生率高家系。

大豆生根率為0～88.33%，其中40%以下家系占67%，生根率在80%以上家系較少，占2%。說明大部分家系生根率較低，在叢生芽伸長出枝條基礎(chǔ)上生根，所以生根率與伸長率變化趨勢(shì)接近。

大豆成苗率為0～80%，其中成苗率30%以下家系占65%，成苗率60%以上家系較少，占6%，說明大部分家系成苗率較低，成苗是在伸長和生根基礎(chǔ)上，導(dǎo)致成苗率與伸長率、生根率變化趨勢(shì)接近。移栽時(shí)受周圍環(huán)境條件和自身生長情況影響，可能導(dǎo)致部分移栽苗在生長過程中死亡，所以大豆再生成苗率偏低。

分析大豆RIL 群體4 個(gè)再生性狀頻數(shù)分布（見圖3），可看出，誘導(dǎo)率、伸長率、生根率和成苗率4個(gè)性狀均表現(xiàn)為連續(xù)單峰曲線，符合正態(tài)分布特征，因此，上述大豆再生性狀在RIL群體中分布屬于典型多基因數(shù)量遺傳。

圖3 大豆RIL群體4個(gè)再生性狀分布Fig.3 Distribution of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

以母本合豐25、父本L-28 以及4 個(gè)家系HP116、HP115、HP93 和 HP92 為例，研究叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽伸長、生根和移苗4個(gè)時(shí)期生長勢(shì)情況（見圖4），合豐25、HP116和HP115叢生芽誘導(dǎo)率為85.00%～96.67%，L-28、HP93和HP92叢生芽誘導(dǎo)率為22.50%～45.61%，再生率為HP116>合豐25>HP115>HP92>HP93>L-28。

2.1.4 大豆RIL群體再生優(yōu)異家系篩選

本研究評(píng)價(jià)大豆RIL 群體100 個(gè)家系再生情況，篩選出8個(gè)再生情況較好家系（見表4）。

由表4可知，HP116誘導(dǎo)率和伸長率均達(dá)90%以上，生根率和成苗率達(dá)80%以上。HP30 誘導(dǎo)率為91.67%，伸長率為71.67%，生根率為65%，成苗率為56.67%。HP122 誘導(dǎo)率為90.57%，伸長率為84.21%，生根率為75.44%，成苗率為64.91%。HP77 誘導(dǎo)率和伸長率均達(dá)80%以上，生根率和成苗率達(dá)70%以上。HP115 和HP104 誘導(dǎo)率和伸長率均達(dá)80%以上，生根率70%以上，成苗率60%以上。HP4 和HP111 誘導(dǎo)率均達(dá)80%以上，伸長率和生根率均達(dá)70%以上，成苗率均達(dá)50%以上。這8 個(gè)家系可為選育高再生率大豆品種提供基礎(chǔ)材料。

圖4 大豆各時(shí)期生長勢(shì)情況Fig.4 Growth appearance of soybean at different stage

2.2 大豆RIL群體再生性狀QTL定位

2.2.1 RIL群體Bin map概況

大豆RIL 群體100個(gè)家系使用滑動(dòng)窗口法作基因分型，并篩選每條染色體bin標(biāo)記，共得到5 221個(gè)重組bin標(biāo)記（見表5），覆蓋20 條染色體，全長6 458.02 cM。

其中6號(hào)染色體最長，為577.27 cM；16號(hào)染色體最短，為175.82 cM。18 號(hào)染色體包含bin 標(biāo)記最多，為381 個(gè)；12 號(hào)染色體包含bin 標(biāo)記最少，為161 個(gè)。平均兩個(gè)bin 間遺傳距離為1.24 cM，6號(hào)染色體平均遺傳距離最大，為1.96 cM；7 號(hào)染色體平均遺傳距離最小，為0.79 cM。

表4 大豆RIL群體中高再生率大豆家系Table 4 Soybean lines with high regeneration rate in RIL population

表5 RIL群體bin map概況Table 5 Summary of bin marker characteristic of RIL population

2.2.2 大豆RIL群體4個(gè)再生性狀QTL定位

通過對(duì)大豆RIL 群體4 個(gè)再生性狀QTL 定位，檢測(cè)到與誘導(dǎo)率顯著相關(guān)位點(diǎn)2個(gè)，分別位于4號(hào)和7 號(hào)染色體，貢獻(xiàn)率分別為11.11%、13.40%（見表6）。檢測(cè)到與伸長率顯著相關(guān)位點(diǎn)3 個(gè)，分別位于2號(hào)、7號(hào)和10號(hào)染色體，貢獻(xiàn)率為11.99%～13.48%。檢測(cè)到與生根率顯著相關(guān)位點(diǎn)3個(gè)，分別位于2 號(hào)、7 號(hào)和10 號(hào)染色體，貢獻(xiàn)率為12.67%～13.69%。檢測(cè)到與成苗率顯著相關(guān)位點(diǎn)2個(gè)，分別位于2 號(hào)和7 號(hào)染色體，貢獻(xiàn)率分別為12.01%和13.89%。

2.2.3 QTL定位穩(wěn)定性和遺傳重疊分析

在大豆 RIL 群體4 個(gè)再生性狀10 個(gè) QTL 位點(diǎn)中，可重復(fù)檢測(cè)到位點(diǎn)（即同時(shí)控制兩個(gè)以上再生性狀QTL位點(diǎn)）共3個(gè)（見表7）?？芍?，同時(shí)與伸長率、生根率QTL 位點(diǎn)1 個(gè)，位于10 號(hào)染色體上，左右標(biāo)記分別為Block5160和Block5159。同時(shí)與伸長率、生根率和成苗率QTL 位點(diǎn)2 個(gè)，分別位于2 號(hào)和7 號(hào)染色體上，左右標(biāo)記分別為Block385 和Block384、Block4036和Block4035。

表6 與大豆再生性狀顯著相關(guān)QTL位點(diǎn)Table 6 QTL loci significantly associated with soybean regeneration indicators

表7 控制不同性狀位點(diǎn)重疊分析Table 7 Overlap analysis for controlling different traits loci

3 討 論

3.1 不同基因型對(duì)大豆再生情況影響

大豆轉(zhuǎn)化率較低，僅為0.2%～10.0%，遠(yuǎn)低于其他雙子葉植物如番茄、擬南芥、煙草等。大豆遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)基因型依賴性較強(qiáng)，不同大豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌敏感程度有差異，選取敏感度較強(qiáng)品種轉(zhuǎn)化可提高轉(zhuǎn)化效率[17]。曲桂芹等選取8個(gè)大豆基因型誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，確定合豐25 和東農(nóng)7819為優(yōu)選基因型[18]。楊明明等以墾農(nóng)18、B12088 和東農(nóng)47 等3 種不同基因型高油大豆品種子葉節(jié)為外植體作遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)墾農(nóng)18 為最佳轉(zhuǎn)化受體[19]。李換麗等選取10 個(gè)大豆品種探究基因型對(duì)大豆再生體系的影響，結(jié)果表明，晉豆37 號(hào)與中黃13 號(hào)在子葉節(jié)再生體系中再生能力比其他品種強(qiáng)，晉豆36號(hào)在胚尖再生體系中再生能力較強(qiáng)[20]。

本研究利用合豐25 與L-28 及其衍生RIL 群體為材料，評(píng)價(jià)大豆再生誘導(dǎo)率、伸長率、生根率和成苗率，篩選得到8個(gè)再生能力較強(qiáng)家系，分別是HP116、HP30、HP122、HP77、HP115、HP104、HP4和HP111，這些家系可為選育高再生率品種提供基礎(chǔ)材料。

3.2 大豆再生性狀QTL位點(diǎn)分析

利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化和改良轉(zhuǎn)基因作物性狀的基礎(chǔ)。近年來，針對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系已開展多項(xiàng)技術(shù)，但大豆仍是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化作物之一。因?yàn)榛蛐?、農(nóng)桿菌菌株、培養(yǎng)環(huán)境、激素種類及濃度等條件均影響遺傳轉(zhuǎn)化效率。因此需研究不同大豆基因型再生能力遺傳基礎(chǔ)。Bolibok 等利用Nipponbare 和Kasalath 構(gòu)建回交群體，定位5 個(gè)控制愈傷組織出芽率QTL 和4 個(gè)控制再生率QTL[21]。楊莉等以日本晴與瀘恢99及其構(gòu)建RIL群體188個(gè)家系為研究對(duì)象，對(duì)同一地點(diǎn)兩年再生率及6個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀基因定位，檢測(cè)到3 個(gè)與再生相關(guān)QTL[22]。王萌以172個(gè)擬南芥生態(tài)型為材料，以根為外植體，對(duì)F2代植株初級(jí)定位，結(jié)果表明，存在3個(gè)與性狀相關(guān)QTL，貢獻(xiàn)率分別為21.4%、27.37%和24.22%[23]。

本試驗(yàn)利用合豐25（子葉節(jié)再生率較高）和L-28（子葉節(jié)再生率較低）雜交衍生RIL群體作QTL定位，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)QTL 與大豆再生性狀顯著相關(guān)，其中獨(dú)立QTL 位點(diǎn)2 個(gè)，可重復(fù)檢測(cè)到QTL 位點(diǎn)3個(gè)。與誘導(dǎo)率顯著關(guān)聯(lián)QTL位點(diǎn)2個(gè)，與伸長率顯著關(guān)聯(lián)QTL位點(diǎn)3個(gè)，與生根率顯著關(guān)聯(lián)QTL 位點(diǎn)3 個(gè)，與成苗率顯著關(guān)聯(lián)QTL 位點(diǎn)2 個(gè)。7 號(hào)染色體上存在與大豆4個(gè)再生性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)，說明該染色體上可能存在與再生相關(guān)基因簇。根據(jù)不同性狀重疊位點(diǎn)標(biāo)記區(qū)間內(nèi)查找出的候選基因，后續(xù)將選取與再生相關(guān)基因作實(shí)時(shí)熒光定量，采用同源重組法作相關(guān)基因克隆。目前關(guān)于大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)QTL 定位尚未見報(bào)道，本研究定位的QTL 位點(diǎn)貢獻(xiàn)率均在10%以上，說明這些QTL位點(diǎn)調(diào)控的基因可能參與大豆子葉節(jié)再生過程，研究結(jié)果將有助于建立大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

4 結(jié) 論

a.在大豆RIL 群體4 個(gè)再生性狀中，誘導(dǎo)率與伸長率、生根率和成苗率均呈極顯著正相關(guān)，伸長率與生根率和成苗率呈極顯著正相關(guān)，生根率與成苗率呈極顯著正相關(guān)。

b.大豆RIL群體叢生芽誘導(dǎo)率主要分布在50%～60%，且誘導(dǎo)率50%以上家系占66%，伸長率和生根率主要分布在30%～40%，成苗率主要分布在20%～30%。4個(gè)性狀均表現(xiàn)為連續(xù)單峰曲線，符合正態(tài)分布特點(diǎn)。

c.在大豆RIL群體中共檢測(cè)到10個(gè)與大豆再生性狀顯著相關(guān)QTL 位點(diǎn)，其中獨(dú)立QTL 位點(diǎn)2 個(gè)，可重復(fù)檢測(cè)QTL位點(diǎn)3個(gè)。與誘導(dǎo)率顯著相關(guān)QTL位點(diǎn)2個(gè)，與伸長率顯著相關(guān)QTL 位點(diǎn)3個(gè)，與生根率顯著相關(guān)QTL 位點(diǎn)3 個(gè)，與成苗率顯著相關(guān)QTL位點(diǎn)2個(gè)。