王 巖，王建宇，于 璐，袁鳳娟，張 萌，吳紅艷，高建偉，王拓一

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米籽粒中主要儲(chǔ)存蛋白為醇溶蛋白，占玉米胚乳蛋白質(zhì)總量35%～60%[1-2]。玉米醇溶蛋白是由大量非極性氨基酸組成的帶正電荷疏水性蛋白質(zhì)，易溶于乙醇水溶液，是玉米深加工最重要的工業(yè)副產(chǎn)物之一[3]。玉米醇溶蛋白主要存在于玉米濕法加工制備淀粉過(guò)程剩余物玉米蛋白粉（玉米黃粉）中[4-5]。雖然玉米醇溶蛋白缺乏以賴氨酸和色氨酸為代表的必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，且不溶于水，但因其特殊的氨基酸組成和物化性質(zhì)，可塑性、涂膜性、可降解性和抗氧化性較好等，可用于果蔬保鮮、食品包裝、可降解材料制備等生產(chǎn)活動(dòng)[5-6]。在特種食品、制藥和生物可降解塑料工業(yè)中應(yīng)用前景廣泛[7-8]。

目前，玉米醇溶蛋白提取主要方法包括異丙醇提取法[9]、乙醇提取法[10-11]、超聲波輔助提取法[12]和微波提取法[13]等。在提取過(guò)程中，提取條件對(duì)玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，最終影響其應(yīng)用性質(zhì)，如抗氧化性[14-15]。因此，從成本和應(yīng)用兩方面，優(yōu)化提取條件，更有利于醇溶蛋白加工利用。

Cook 等對(duì)比不同有機(jī)溶劑對(duì)玉米醇溶蛋白影響，結(jié)果表明提取從高到低依次為乙酸、60%異丙醇、90%乙醇和80%乙醇，說(shuō)明不同有機(jī)溶劑和濃度影響提取率，并指出采用兩種溶劑系統(tǒng)提取更便于玉米醇溶蛋白回收[16]。張媛媛研究結(jié)果表明，利用微波輔助提取工藝，極大縮短提取時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，但因于過(guò)程中內(nèi)部溫度驟升，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響加工性能[13]。Gu 等采用超聲波輔助提取玉米醇溶蛋白，提高提取效率，降低提取溫度，同樣對(duì)蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)造成一定程度影響，提取的玉米醇溶蛋白純度高[17]。任曉峰等研究表明，超聲波輔助處理增加玉米醇溶蛋白水溶性，顯著提高提取效率[18]。目前工業(yè)上大規(guī)模制備玉米醇溶蛋白主要以乙醇為提取溶劑，通過(guò)物理和生物技術(shù)等手段輔助提高提取效率，一定程度上改變玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和功能。

本文以玉米蛋白粉為原料，選取超聲波輔助提取，選擇提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、pH和固液比5個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，再通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取過(guò)程參數(shù)，確定最佳提取工藝，評(píng)價(jià)已提取醇溶蛋白抗氧化活性，以期為醇溶蛋白提取、加工和利用提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉（購(gòu)自齊齊哈爾阜豐生物科技有限公司），無(wú)水乙醇、氫氧化納、鹽酸、DPPH、ABTS+·、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)硫酸鉀和抗壞血酸等均為分析純（購(gòu)自阿拉丁試劑上海有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備

SK3300HP 超聲波清洗機(jī)（購(gòu)自上?？茖?dǎo)超導(dǎo)儀器有限公司），SH2-D 循環(huán)水式真空泵（購(gòu)自鞏義市英峪予華儀器廠），DF-Ⅱ集熱式磁力攪拌器（購(gòu)自江蘇省金環(huán)市醫(yī)療儀器廠），DHG-9145A 電熱恒溫古風(fēng)干燥箱（購(gòu)自上海一恒科技有限公司），步琦K370 全自動(dòng)凱式定氮儀（購(gòu)自瑞士步琦有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白提取工藝流程

玉米蛋白粉→過(guò)篩（80 目）→加入乙醇→調(diào)pH、溫度→超聲波輔助提?。üβ?80 W）→離心分離→上清液→凍干→醇溶蛋白

1.3.2 玉米醇溶蛋白提取率測(cè)定

玉米醇溶蛋白提取率（%）=提取玉米醇溶蛋白質(zhì)量（g）/玉米黃粉質(zhì)量（g）×100%

1.3.3 玉米醇溶蛋白純度測(cè)定

采用GB 5009.5-2016測(cè)定[19]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

乙醇濃度、固液比、pH、提取時(shí)間4 個(gè)因素為自變量，分別以x1、x2、x3、x4表示，根據(jù)現(xiàn)有試驗(yàn)條件及相關(guān)前期試驗(yàn)，確定其取值為60%～90%、1∶4～1∶13 g·mL-1、30～90 min。按方程Xi=(x1-x0)/Δx對(duì)自變量編碼，并以自變量編碼值+1、0、-1分別代表自變量高、中、低水平。玉米醇溶蛋白提取率YA為響應(yīng)值，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)自變量因素編碼及水平Table 1 Code and level of independent variables in response surface test

1.3.5 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Z(yǔ)hang 等方法測(cè)定[20]，略有改動(dòng)：新鮮制備DPPH 溶液（0.1 mmol·L-1），將其保存在蓋有鋁箔燒瓶中，兩次測(cè)量之間保證4 ℃黑暗環(huán)境。在0.1 mmol·L-1DPPH 溶液中，將 2 mL 醇溶蛋白，加入到0.2 mL 提取液中并劇烈搖動(dòng)。然后將試管在黑暗中放置室溫30 min。同時(shí)制備DPPH 對(duì)照樣品，并將乙醇用于空白。使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量517 nm 處吸光度降低。記錄吸光度降低百分比，基于觀察到的自由基吸收度降低以計(jì)算DPPH自由基清除百分比。

1.3.6 ABTS+·自由基清除率測(cè)定

參照Al-Weshahy 等方法測(cè)定[21]，略有改動(dòng)：通過(guò)將 ABTS 溶液（7 mmol·L-1）與 13.24 mg 過(guò)硫酸鉀混合16 h，生成ABTS 自由基。將所得溶液冷藏、稀釋，在734 nm 處吸光度為0.70。將100 mL樣品與1.9 mL ABTS+·混合，然后放置7 min后，在734 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.7 羥基自由基清除率測(cè)定

參照Fenton反應(yīng)方法建立反應(yīng)體系模型[22]，略有改動(dòng)。反應(yīng)混合物由10 mmol·L-1FeSO4-EDTA（0.15 mL），10 mmol·L-1H2SO（40.15 mL），0.15 mL H2O 和 0.15 mol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，0.3 mL）。添加樣品溶液（提取物，0.15 mL）后，將合并混合物在37 ℃下反應(yīng)10 min，然后通過(guò)添加1%巴比妥酸（0.7 mL）和2.8%三氯乙酸（0.7 mL）終止反應(yīng)。將該溶液在水浴中加熱5 min，然后冷卻至25 ℃。與抗壞血酸比較，在510 nm 處讀取混合溶液吸光度（陽(yáng)性對(duì)照）。根據(jù)以下方程式，以百分比形式分析影響。

1.3.8 自由基清除率計(jì)算公式

使用以下公式計(jì)算DPPH、ABTS+·、羥基自由基清除率。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.9 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，采用Design-Ex?pert 8.0.6、SPSS 19.0軟件分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

在80%乙醇濃度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，超聲波輔助處理30 min，分別在30～80 ℃下提取，研究溫度對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

一般來(lái)說(shuō)，溫度升高有利于溶質(zhì)宏觀傳質(zhì)速率，溫度較低時(shí)，提高溫度增加分子動(dòng)能，提高溶質(zhì)擴(kuò)散速率，增加醇溶蛋白提取率。由圖1 可知，由30 ℃升至60 ℃時(shí)玉米醇溶蛋白提取率不斷提高，當(dāng)溫度升至70 ℃及以上時(shí)提取率明顯下降，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因溫度過(guò)高導(dǎo)致部分蛋白變性，使醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解度降低。

圖1 提取溫度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on the extraction rate of zein

2.2 提取時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

在80%乙醇濃度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，溫度70 ℃，超聲波輔助處理20～120 min 條件下提取原料，研究提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of extraction time on the extraction rate of zein

醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解及擴(kuò)散均需一定時(shí)間，隨提取時(shí)間增加，有利于蛋白質(zhì)顆粒完全浸取，更易破壞醇溶蛋白和其他物質(zhì)結(jié)合，促使在乙醇溶液中溶解，但隨時(shí)間增加，浸取速度下降，提取率將逐步保持恒定。由圖2可知，隨超聲時(shí)間增加，醇溶蛋白提取率逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間增至80 min以上時(shí)，提取率增加緩慢。

2.3 乙醇濃度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

在固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，溫度70 ℃，超聲波輔助處理80 min，乙醇濃度50%～100%條件下提取原料，研究乙醇濃度對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of ethanol concentration on the extraction rate of zein

由圖3可知，隨乙醇濃度增加，醇溶蛋白提取率先增后降，乙醇濃度為70%時(shí)提取率最大。此時(shí)因70%濃度乙醇極性與醇溶蛋白接近，根據(jù)相似相容原理，提取率達(dá)最大值。

2.4 pH對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

在固液比1∶10 g·mL-1，乙醇濃度70%，溫度70 ℃，超聲波輔助處理 80 min，pH 8～13 提取原料，研究pH對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of pH on the extraction rate of zein

由圖4 可知，不同pH 對(duì)醇溶蛋白提取率影響較大，隨pH 逐漸增大，提取率呈先增后減趨勢(shì)，原因可能為堿性條件有利于增加醇溶蛋白溶解性，但pH過(guò)高破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，反應(yīng)在強(qiáng)堿條件下提取率反而下降的趨勢(shì)。

2.5 固液比對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

在乙醇濃度70%，溫度70 ℃，超聲波輔助處理80 min，pH 11，固液比1∶8～1∶18 g·mL-1條件下提取原料，研究固液比對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨固液比增加，醇溶蛋白提取率逐漸增加，原因在于隨溶劑增加，醇溶蛋白大量暴露于乙醇水溶液，便于游離，但一旦溶劑溶解溶質(zhì)達(dá)到飽和，提取率不再增加。

圖5 固液比對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on the extraction rate of zein

2.6 玉米醇溶蛋白提取工藝模型建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6 軟件建立試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸分析，得到二次多元回歸方程（模型）為:

表3為模型方差分析結(jié)果，表4為模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果。對(duì)方程F檢驗(yàn)可得出，失擬檢驗(yàn)得到F失擬=0.52F0.01（14，4）=2.39，檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好，可反映提取率與4 個(gè)因素之間關(guān)系，同時(shí)，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9672，可分析和預(yù)測(cè)提取玉米醇溶蛋白提取工藝。

表4 為回歸系數(shù)取值及方差分析結(jié)果，可知，x2、x1x4和x1x3項(xiàng)對(duì)提取率影響極顯著，x1，x3x4對(duì)提取率影響顯著，其他因素影響不顯著。通過(guò)回歸系數(shù)絕對(duì)值，得出提取率影響順序?yàn)楣桃罕?乙醇濃度>提取時(shí)間>pH。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surfacex test design and results

表3 回歸模型顯著性分析Table 3 Significance analysis of regression model

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of regression equation coefficients

2.7 玉米醇溶蛋白提取率中各因素交互作用分析

由圖6 可知，pH 不變，隨乙醇濃度增加，玉米醇溶蛋白提取率呈先增后降趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度不變，pH 6～12 不斷變化時(shí)，增大pH，提取率升高，當(dāng)pH 達(dá)到中性時(shí)提取率增加趨于平緩并呈下降趨勢(shì)，原因在于堿性條件有利于醇溶蛋白在乙醇溶液中溶出。

由圖7可知，時(shí)間不變，隨乙醇濃度增加，提取率呈先升后降趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度恒定，時(shí)間在30～90 min 內(nèi)變化，隨時(shí)間延長(zhǎng)提取率逐漸增加，最大提取率達(dá)22.51%，當(dāng)時(shí)間達(dá)一定數(shù)值時(shí)，提取率趨于平緩。因本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取，超聲波作用可有效打破溶質(zhì)和溶劑邊界層，加速媒介細(xì)化和混合，隨時(shí)間增加，提高萃取速率。

圖6 pH和乙醇濃度對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Influence of pH and ethanol concentration on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖7 乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.7 Influence of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

由圖8 可知，時(shí)間不變，隨pH 逐步增加，玉米醇溶蛋白提取率液逐步增加，當(dāng)pH達(dá)到一定值時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)，這是由于玉米醇溶蛋白在中性或是偏堿性溶液中溶解性更好，酸堿性過(guò)強(qiáng)反而降低溶解度；當(dāng)pH 不變，在30～90 min 范圍內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)提取率增加，而當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)。

由圖9 可知，當(dāng)固液比不變，隨乙醇濃度增加，提取率隨之增加，而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)升高，提取率反而呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎诤弑壤菢O性氨基酸玉米醇溶蛋白和其含有的其他氨基酸共同作用，在水或無(wú)水乙醇中的溶解度出現(xiàn)反復(fù)現(xiàn)象，隨乙醇濃度變化，醇溶蛋白溶解性也發(fā)生改變；當(dāng)乙醇濃度一定，固液比在4～13 g·mL-1內(nèi)變化，隨固液比增加玉米醇溶蛋白提取率逐漸增加。

由圖10可知，pH不變，隨固液比增加，玉米醇溶蛋白提取率逐步增加。因增加溶劑用量，有利于玉米醇溶蛋白在其中更充分溶解，然而不斷增加溶劑用量，溶解度增長(zhǎng)趨勢(shì)急劇變小，從成本考慮，利用增加固液比提高產(chǎn)率并不經(jīng)濟(jì)；當(dāng)固液比不變，pH 6～9 內(nèi)變化，提取率不斷增加，再持續(xù)增加pH，提取率呈下降趨勢(shì)。

由圖11 可知，當(dāng)時(shí)間保持恒定，固液比增加，提取率逐步增加；當(dāng)固液比不變，時(shí)間在30～90 min內(nèi)變化，時(shí)間增加，提取率增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到某一時(shí)刻，提取率呈輕微下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎跁r(shí)間增加，原料在溶劑中更好溶解，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原料中蛋白發(fā)生變性等，親水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致提取率出現(xiàn)下降。

圖8 pH和提取時(shí)間對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.8 Influence of pH and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖9 乙醇濃度、固液比對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.9 Influence of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖10 pH、固液比對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.10 Influence of pH and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖11 時(shí)間、固液比對(duì)提取率影響的等高面和響應(yīng)曲面圖Fig.11 Influence of extraction time and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

2.8 響應(yīng)面方程驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 軟件得出最佳提取工藝為：乙醇濃度82.86 %，固液比1∶13 g·mL-1，pH 11.56，時(shí)間83.07 min，該條件下，提取率最大值為28.33%。根據(jù)實(shí)際操作，將最佳條件變?yōu)橐掖紳舛?0%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、提取時(shí)間83 min，實(shí)際提取率為27.87%，理論預(yù)測(cè)與實(shí)際提取誤差為1.6%，此時(shí)醇溶蛋白純度為92.47%。

2.9 提取醇溶蛋白抗氧化評(píng)價(jià)

對(duì)提取出的醇溶蛋白作DPPH、ABTS+·和羥自由基清除能力如圖12～14所示。已提取醇溶蛋白具有清除3種自由基作用，濃度2～10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH、ABTS+·和羥自由基清除率分別為30.12%～50.36%、20.12%～50.66%、22.12%～68.76%，抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照其抗氧化能力如圖所示。

圖12 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

圖13 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對(duì)ABTS+·自由基清除率Fig.13 ABTS+·scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

圖14 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對(duì)羥自由基清除率Fig.14 Hydroxyl free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

3 討論與結(jié)論

從玉米蛋白粉中提取高品質(zhì)玉米醇溶蛋白，有利于醇溶蛋白后續(xù)加工利用，傳統(tǒng)工業(yè)主要以有機(jī)溶劑作為萃取劑，雖然丙酮和異丙醇提取效果略優(yōu)于乙醇，但存在毒性較大，回收成本和損失率高等缺點(diǎn)，采用乙醇水溶液提取醇溶蛋白是目前主流提取方式[19]。

超聲波輔助提取工藝，操作簡(jiǎn)單，熱能消耗低，成本低，提取時(shí)間短，李麗杰等[11]，李娜等[23]，王緲等[24]，趙華等[25]，均利用超聲波輔助提取方式優(yōu)化玉米醇溶蛋白提取工藝，但在試驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中pH 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響未納入研究因素。Liu 等研究結(jié)果表明，堿性條件有利于醇溶蛋白在乙醇水溶液的提取[9]，本研究結(jié)果也表明，堿性條件下有利于提高提取率。

雖然和抗壞血酸比，提取得到的醇溶蛋白抗氧化能力有一定差距，但隨醇溶蛋白濃度增加，對(duì)3種自由基的清除也逐漸提高，提取得到的醇溶蛋白具有較強(qiáng)自由基清除能力，可解釋醇溶蛋白產(chǎn)生應(yīng)用價(jià)值的原因，如油脂抗氧化性。在提取過(guò)程中不同提取條件改變醇溶蛋白微觀結(jié)構(gòu)，影響玉米醇溶蛋白提取工藝，因此，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)對(duì)玉米醇溶蛋白在加工過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化和后續(xù)加工特性影響作為研究方向。

本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、pH、固液比和乙醇濃度因素作Box-Behnken響應(yīng)面分析，得到最佳提取條件為，乙醇濃度80%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、超聲時(shí)間83 min，提取溫度70 ℃，各因素對(duì)提取率影響依次為固液比>提取率>乙醇濃度>提取時(shí)間>pH；采用DPPH、ABTS+·和羥基自由基3 種方法評(píng)價(jià)提取的玉米醇溶蛋白抗氧化能力，表明提取的玉米醇溶蛋白具有一定自由基清除能力。以上結(jié)果為進(jìn)一步利用玉米加工副產(chǎn)物提供工藝參考，也為更好開(kāi)發(fā)醇溶蛋白生物活性和加工領(lǐng)域提供參考。