李藝昕，趙愛利，郭福川

(1.福建醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，福建 福州 350122； 2.福建醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，福建 福州 350122)

隨生活方式和飲食習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率逐年增加，是慢性肝病的主要病因之一[1]，以肝臟中脂肪異常蓄積、肝細(xì)胞產(chǎn)生脂肪變?yōu)樘卣鱗2]。降低血脂水平可以延緩NAFLD的進(jìn)展。

滸苔(Enteromorphaprolifera，E.prolifera)是一種藥食兩用的大型經(jīng)濟(jì)類海洋綠藻，廣泛存在于我國東南部沿海潮間帶[3]。研究表明藻類硫酸多糖具有多種生物活性[4]。滸苔多糖(Enteromorpha polysaccharide，EP)是從滸苔中提取得到的一種硫酸多糖，具有抗氧化[5]、降血糖[6]、降血脂[7]等多種功效。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認(rèn)為是第三種氣體信號分子[8]，不僅可預(yù)防缺血再灌注損傷和心力衰竭[9]，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]，在肝臟生理和病理生理中也起著重要作用[11]。肝臟中甘油三酯(triglyceride，TG)的生成增加和/或清除降低可導(dǎo)致高甘油三酯血癥，研究顯示，高甘油三酯血癥患者的血清H2S水平低于正常對照人群[12]。另有研究報(bào)道，NaHS(H2S的供體)干預(yù)可顯著降低高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠血清TG水平[13]。

在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)源性H2S主要通過特殊酶催化反應(yīng)生成[8]：以同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)為底物，在胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β- synthase，CBS)的催化作用下，代謝成L-型半胱氨酸和H2S，隨后，生成的L-型半胱氨酸在CBS、CSE的催化下進(jìn)一步代謝生成H2S。

本課題組前期研究中觀察到EP可增加H2S生成，降低血清及肝臟TG水平[14]，但EP誘導(dǎo)H2S生成的機(jī)制仍不明確。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD大鼠模型，并采用EP進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，探討EP對大鼠肝臟脂質(zhì)代謝、血清H2S水平以及多器官CBS/CSE酶活性和蛋白的表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 多糖的分離純化

采用水萃取-乙醇沉淀法分離提純出EP[6]。參照林勇[15]采用苯酚-硫酸法測得滸苔多糖的含量為62.66%，硫酸鋇比濁法測得滸苔多糖硫酸根含量為16.42%。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雌性SD大鼠(7周齡，體重180～200 g)由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號：SCXK(閩)2016-0002]。飼養(yǎng)條件：溫度(22±1)℃、濕度(50%～60%)、12 h/12 h晝夜節(jié)律。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：空白對照組(Control group, Normal diet+H2O，ig)、EP對照組(EP control group, Normal diet+EP，ig)、模型組(Model group，High-fat diet+H2O，ig)、EP干預(yù)組(EP intervention group, High-fat diet+EP，ig)和硫氫化鈉組(NaHS group，High-fat diet+NaHS，ip)?？瞻讓φ战M、EP對照組喂食正常飼料(Normal diet)，另外三組喂食高脂飼料(High-fat diet)。EP干預(yù)劑量為200 mg/(kg·bw·d)。NaHS干預(yù)劑量為56 μmol/(kg·bw·d)。連續(xù)干預(yù)35 d，5組大鼠其他常規(guī)條件一致。

干預(yù)結(jié)束后，禁食12 h，麻醉取血，取血清，按試劑盒說明定量測定血脂水平：總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。將肝臟分離稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝重/體重×100%)，并分離腦、脾、腎、心、肺等器官，立即用液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱。

1.3 飼 料

正常飼料LAD0011(南通特洛菲飼料科技有限公司)：小麥粉，玉米粉，次粉，豆粕，玉米蛋白粉，植物油，啤酒，酵母，鹽，賴氨酸，蛋氨酸，礦物質(zhì)預(yù)混料，維生素預(yù)混料?？偀崃?.4 kcal/g，熱量比為：蛋白質(zhì)22%，碳水化合物65%，脂肪13%。

高脂飼料TP0800(南通特洛菲飼料科技有限公司)：在正常飼料中添加蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鈉、酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等?？偀崃?.04 kcal/g，熱量比為：蛋白質(zhì)13%，碳水化合物50%，脂肪37%。

1.4 肝臟組織病理分析

取肝臟，固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.5 血清H2S水平及腦、肺、肝、心、脾、腎組織CSE/CBS活性測定

血清中的H2S測定：100 μL血清或標(biāo)準(zhǔn)品與100 μL三氯乙酸(10%)混合，室溫反應(yīng)10 min，離心(12 000 g，4 ℃)10 min。取80 μL上清液與60 μL醋酸鋅(1%)，40 μL N，N-二甲基對苯二胺硫酸鹽(20 mmol/L溶于7.2 mol/L HCl)和40 μL FeCl3(30 mmol/L溶于1.2 mol/L HCl)混合，在室溫下反應(yīng)13 min。

組織中CSE/CBS活性測定：在100 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.4)中勻漿，離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min，取430 μL上清液與20 μL L-半胱氨酸(20 mmol/L)、20 μL 5′-磷酸吡哆醛(2 mmol/L)和30 μL 0.9%氯化鈉混合，并在37 ℃ 水浴中反應(yīng)35 min。加入250 μL的醋酸鋅(1%)和250 μL三氯乙酸(10%)以終止反應(yīng)，混勻離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min，取500 μL上清液，加入133 μL N，N-二甲基對苯二胺硫酸鹽和133 μL FeCl3，在室溫下反應(yīng)13 min。

對剪切型三層框架建筑模型在各種地震波作用下進(jìn)行加速度時(shí)程測量，包括將測量儀放在頂層和放在第二層兩種情況。將所測得的加速度時(shí)程反應(yīng)數(shù)據(jù)通過FFT（快速富利哀變換）處理轉(zhuǎn)換至頻域。然后在所得的加速度幅值譜上，從0～20Hz范圍內(nèi)等距地取出200個(gè)點(diǎn)的相應(yīng)幅值作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。參見圖1。

13 min后測量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在670 nm處的吸光度。根據(jù)NaHS(3.125～200) μmol/L校準(zhǔn)曲線計(jì)算H2S濃度[16]，最終的酶活性[nmol/(min·g)]=1 000×組織中產(chǎn)生H2S濃度(μmol/L)/[組織勻漿蛋白濃度(mg/mL)×35 min]。

1.6 Western Blot檢測CBS、CSE蛋白表達(dá)水平

冰上制備勻漿，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，在4 ℃下與一抗(抗CSE/CBS/β-actin)孵育過夜(Proteintech)。與抗小鼠或抗兔IgG抗體(Proteintech)在室溫下孵育1 h后，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察免疫反應(yīng)帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用mean±SEM表示。多組間比較采取One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響

各組大鼠初始體重?zé)o顯著差異，高脂飼料喂養(yǎng)5周后，模型組大鼠體重顯著高于空白對照組(P<0.05)。高脂飼料喂養(yǎng)大鼠各組間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。見圖1。此外，各組大鼠的攝食量無顯著差異。

2.2 EP對高脂飲食大鼠肝臟的影響

高脂飼料喂養(yǎng)可使大鼠肝臟體積增大并出現(xiàn)脂肪變性，肝臟顏色由深棕色變?yōu)樽攸S色(圖2A)。正常飼料喂養(yǎng)的兩組大鼠，肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)完整。而模型組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞體積明顯變大呈氣球樣變，胞核固縮且數(shù)量明顯減少，空泡變多，周圍部分區(qū)域有炎癥細(xì)胞浸潤。EP和NaHS干預(yù)后肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常，體積增大但形態(tài)仍較完整，脂肪變性細(xì)胞數(shù)量減少，有輕微的炎性細(xì)胞浸潤(圖2B)。

圖1 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.1 Effects of EP on body weight gain of the rats fed with high-fat diet

正常飲食的兩組大鼠肝臟系數(shù)無顯著差異(P>0.05)；高脂飲食的三組大鼠肝臟系數(shù)顯著高于正常飲食的兩組(P<0.05)；而同樣喂食高脂飼料的三組大鼠， EP和NaHS干預(yù)后，肝臟系數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血清TC、TG、LDL-C水平的影響

高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的TG、TC和LDL-C顯著高于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較，EP和NaHS干預(yù)可顯著降低血清TG、TC和LDL-C水平(P<0.05)。見圖3。

2.4 EP對H2S水平和肝、心、腦、腎、脾CSE/CBS酶活性的影響

正常飼料喂養(yǎng)的兩組大鼠中，與空白對照組比較，EP對照組血清H2S水平無顯著改變，但在高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠中，EP和NaHS干預(yù)后血清H2S水平顯著高于模型組(P<0.05)。模型組大鼠肝、心、腦的CBS/CES酶活性顯著低于空白對照組(P<0.05)，EP和NaHS干預(yù)后CBS/CES活性升高(P<0.05)。不論是正常飲食還是高脂飲食，EP均能提高腎、脾的CBS/CES活性(P<0.05)。肺組織中CBS/CES活性低于檢測限值(<3.125 μmol/L)。見圖4。

A：干預(yù)期結(jié)束后肝臟大體外觀比較；B：大鼠肝臟HE染色結(jié)果(×400)，箭頭示脂肪空泡圖2 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝的影響Fig.2 Effects of EP on livers of the rats fed with high-fat diet

表1 各組大鼠干預(yù)期結(jié)束后的肝臟系數(shù)比較

A：大鼠血清TG濃度水平；B：大鼠血清TC濃度水平；C：大鼠血清LDL-C濃度水平；D：大鼠血清HDL-C濃度水平。a：與Control組比較，P<0.05；b：與模型組比較， P<0.05圖3 EP干預(yù)對大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平的影響Fig.3 Effects of EP on TG，TC，LDL-C and HDL-C in the serum of the rats in each group

A：大鼠血清H2S濃度水平比較；B：大鼠肝臟CSE/CBS酶活性比較；C：大鼠心臟CSE/CBS酶活性比較；D：大鼠大腦CSE/CBS酶活性比較；E：大鼠腎臟CSE/CBS酶活性比較；F：大鼠脾臟CSE/CBS酶活性比較。a：與Control組比較，P<0.05；b：與Model組比較， P<0.05；c：與高脂飼料喂養(yǎng)的EP干預(yù)組比較，P<0.05圖4 EP對大鼠血清H2S濃度及各臟器CSE、CBS酶活性的影響Fig.4 Effects of EP on H2S level in the serum and CSE/CBS activity in liver，heart，brain，kidney and spleen

2.5 EP對各器官CBS、CSE蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與模型組相比，EP干預(yù)組大鼠腦內(nèi)CBS和CSE蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。在脾臟和肝臟，EP顯著增加高脂飲食喂養(yǎng)大鼠CBS蛋白的表達(dá)(P<0.05)，但對CSE的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。在心臟和腎臟，EP顯著增加高脂飲食喂養(yǎng)大鼠CSE蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而對CBS的表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)成年雌性SD大鼠35 d建立NAFLD模型，模型組肝重、肝臟指數(shù)、肝臟病理切片、血脂等指標(biāo)的變化，均提示造模成功。

表2 高脂飲食喂養(yǎng)大鼠血清H2S水平與脂質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

EP干預(yù)可降低高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠的血清TC、TG、LDL-C水平，減少肝細(xì)胞脂肪變性。由此可見，EP可以改善NAFLD大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝，但對正常飲食大鼠脂質(zhì)代謝無明顯影響。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠血清 H2S水平與血清TC、TG以及LDL-C水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此推測EP 改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝的作用可能與其調(diào)節(jié)血清H2S含量有關(guān)。

H2S是一種重要的內(nèi)源性血管舒張因子，有研究表明，H2S可通過抗炎、抗氧化和抗纖維化[17]等作用，延緩大鼠肝纖維化并抑制肝臟脂代謝紊亂。有研究報(bào)道，NAFLD大鼠內(nèi)源性H2S形成受損，H2S治療可能通過減輕氧化應(yīng)激和抑制炎癥來延緩NAFLD的發(fā)生發(fā)展[18]。在本研究中，NaHS作為外源性H2S供體，能夠升高NAFLD大鼠體內(nèi)H2S濃度，而EP干預(yù)后H2S濃度變化與NaHS干預(yù)后結(jié)果一致，提示其可能作為H2S供體促進(jìn)H2S的生成。

A：大鼠腦組織CBS、CSE蛋白表達(dá)；B：大鼠肝臟組織CBS、CSE蛋白表達(dá)；C：大鼠脾臟組織CBS、CSE蛋白表達(dá)；D：大鼠心臟組織CBS、CSE蛋白表達(dá)；E：大鼠腎臟組織CBS、CSE蛋白表達(dá)。a：與Control組比較，P<0.05；b：與Model組比較， P<0.05圖5 EP對大鼠各臟器CSE、CBS蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of EP on CSE and CBS protein expression in liver，heart，brain，kidney and spleen

哺乳動(dòng)物體內(nèi)，CSE主要存在于心血管系統(tǒng)、肝臟和腎臟[19]中，而CBS則主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或神經(jīng)元中，在大腦的海馬體和小腦中高度表達(dá)[20]。本研究觀察到大鼠腦、脾、肝、腎和心臟均有CSE和CBS的表達(dá)。但在不同臟器中，其活性不同，在肺中其活性低于檢測限。在高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠中，EP及NaHS干預(yù)后，各臟器CSE/CBS酶活性較模型組顯著升高。說明EP對NAFLD大鼠體內(nèi)CSE/CBS酶的活性有保護(hù)和促進(jìn)的作用。此外，在EP干預(yù)后，NAFLD大鼠腦內(nèi)CBS和CSE的蛋白表達(dá)顯著增加；在脾臟和肝臟，EP主要影響CBS蛋白表達(dá)；在心臟和腎臟中，EP則主要影響CSE蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明EP對NAFLD大鼠不同臟器組織CBS、CSE表達(dá)的影響不同。提示EP可能通過影響CSE、CBS蛋白的表達(dá)，促使內(nèi)源性H2S含量升高。但在正常飲食大鼠體內(nèi)各臟器中，EP對CSE、CBS的表達(dá)均無顯著影響。

同型半胱氨酸(Hcy)是產(chǎn)生H2S的底物。動(dòng)物研究表明，缺乏CSE或CBS會(huì)導(dǎo)致血清中Hcy水平升高或高同型半胱氨酸血癥[21]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，EP可增加高脂飲食大鼠的血清L-半胱氨酸水平，而CSE活性抑制劑則可抑制EP引起的H2S升高，并顯著增加EP干預(yù)組大鼠的血清Hcy水平。肝臟是Hcy代謝的關(guān)鍵器官，可調(diào)節(jié)血漿Hcy水平[22]。本研究結(jié)果顯示，EP可上調(diào)肝臟CBS蛋白表達(dá)和CBS活性，表明EP可能具有預(yù)防高同型半胱氨酸血癥的作用。

綜上所述，EP可能通過上調(diào)NAFLD大鼠多個(gè)器官CBS/CSE蛋白表達(dá)，提高CBS/CSE酶活性，從而提高血清H2S水平，改善NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝。此外，H2S還具有其他多種生物學(xué)效應(yīng)，本研究結(jié)果為EP的其他生物活性效應(yīng)研究提供了新的線索。