肖恩星 曾文靜 曾彥達(dá) 張啟軍 馮昊

摘要對一份引自美國的水稻資源（編號為GSOR643131，2012年正季播種編號為128272，簡寫為8272）進(jìn)行觀察分析，發(fā)現(xiàn)該資源在較高溫光條件下葉片發(fā)生不可逆的黃化，葉綠素含量明顯下降;利用8272/9311雜交F2群體，明確了該性狀受一個隱性核基因控制，并初步定位在水稻第4染色體SSR標(biāo)記RM16931與RM16942之間，其遺傳距離分別為0.8和3.3cM。進(jìn)一步設(shè)計引物和擴(kuò)大F2分離群體，將該基因定位在RM16931與InDel標(biāo)記ID42之間約117kb的區(qū)間內(nèi);通過對8272和9311的重測序數(shù)據(jù)在引物區(qū)間進(jìn)行SNP差異性篩選和候選基因的GO分析，結(jié)果表明，BGIOSGA015140基因可能是引起8272黃化性狀的候選基因。通過該研究可為解析水稻葉色變化機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞水稻;黃化突變體;基因定位;篩選

中圖分類號S511;S326;[Q37]文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2021）08-0094-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

ScreeningoftheCandidateGenesforaRiceLeafChlorosisMutant8272

XIAOEn-xing1，ZENGWen-jing2，ZENGYan-da1etal（1.InstituteofFoodCrops，JiangsuAcademyofAgriculturalScience，Nanjing，Jiangsu210014;2.CollegeofLifeScience，ChinaWestNormalUniversity，Nanchong，Sichuan637009）

AbstractAriceresource8272（GSOR643131）introducedfromtheUnitedStates，wasfoundthattheleaveswereirreversiblyyellowingunderhightemperaturecompaniedwithhighlightintensity，itschlorophyllcontentwassignificantlyreduced.F2（8272/9311）populationconfirmedthatthistraitwasregulatedbyasinglerecessivenucleargene.Firstly，thisgenewaslocatedbetweenRM16931andRM16942onthechromosome4ofrice，andwiththegeneticdistanceof0.8cMand3.3cM，respectivelytothetwomarkers.Secondly，itwaslocatedinasectionabout117kbbetweenRM16931andIndelmarkerID42usingnewprimersandabiggerF2population.Finally，re-sequencingdataandSNPdifferentialscreeningof8272and9311showedthatBGIOSGA011540genemightbethecandidategene.Thisstudymaylayacertainfoundationforfurtherresolutionofthericeleafcolorchangingmechanism.

KeywordsRice;Leafyellowingmutant;Genemapping;Screening

水稻（OryzasativaL.）不僅是我國乃至全世界人民的糧食作物，還是單子葉植物功能基因組研究的模式作物[1-2]，由于植物葉色變化容易辨認(rèn)，故與水稻葉色相關(guān)的表型也被不斷發(fā)現(xiàn)與報道[3]。在早期，葉色突變體不被研究者重視，主要是因為大多數(shù)葉色突變體植株體內(nèi)葉綠素的生物合成或者降解過程受到突變基因調(diào)控后其效率一般會下降，進(jìn)而導(dǎo)致突變體植株的產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株死亡[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，不斷被挖掘的水稻葉色突變體在探索植株的光合、生理等方面發(fā)揮著更大的作用[5]，而且葉色還作為顏色標(biāo)記在雜交水稻的制種過程中起到去雜保純的作用，為水稻良種繁育和雜交種的生產(chǎn)提供了新的育種思路[6-8]。一些研究還表明，葉色突變體在植物的光合作用[9]、光形態(tài)建成[10]、激素生理[11]、核-質(zhì)基因互作以及信號傳導(dǎo)途徑[12]等方面也具有研究價值，甚至可應(yīng)用到水稻高光效育種[13]中。因此，對水稻葉色突變體材料不斷進(jìn)行深入的發(fā)掘與研究，對水稻光合生理探索及其利用均具有較為重要的意義。

從美國引進(jìn)的水稻材料8272（編號為GSOR643131，2012年正季播種編號為128272，簡寫為8272）在南京5月初播種，種植過程中發(fā)現(xiàn)在7月上旬梅雨結(jié)束、迎來高溫強(qiáng)光的生長條件下，葉尖由綠開始黃化，黃化后的性狀不再轉(zhuǎn)綠而伴隨著整個生育期。該研究用該突變體材料與全生育期葉色正常的秈稻9311進(jìn)行雜交，對后代進(jìn)行遺傳分析，通過水稻SSR和Indel標(biāo)記對控制該突變體性狀進(jìn)行基因定位，對候選基因進(jìn)行SNP位點差異和GO分析，為該基因的圖位克隆與功能研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

突變體8272是2012年從美國引進(jìn)資源（編號為GSOR643131，2012年正季播種編號為128272，簡寫為8272）中發(fā)現(xiàn)的葉色黃化突變體，在較高溫光前葉片表現(xiàn)為正常的綠色，在一段時間較高溫光后8272的葉尖顏色從上至下逐漸變黃，而秈稻9311在黃熟前都表現(xiàn)為正常的綠色。利用8272與9311進(jìn)行正反交配組，制備F1，并自交后繁衍為F2群體。在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自有的水稻基地分別配制和種植以上試驗材料。

1.2試驗方法

1.2.1色素含量測定。

選取8272和9311的幼苗期（正常綠色）和抽穗期（8272葉尖已黃化）2個階段進(jìn)行色素含量的測定，稱取剪去中脈的新鮮葉片0.02g放入10mL的離心管中，加入95%乙醇后置于4℃冰箱中浸提24h。隨后取一定量的浸提液于比色杯中，并以95%乙醇作為對照，分別測定波長為665、649和470nm下的吸光度。參照Lichtenthaler[14]的方法計算葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和β-胡蘿卜素（β-Car）的含量，計算公式為：Chla=13.95D665-6.88D649;Chlb=24.96D649-7.32D665;β-Car=（1000D470-2.05Chla-114Chlb）/245。葉綠素濃度為葉綠素a和葉綠素b二者之和。葉綠體色素含量=色素濃度（mg/L）×提取液體積（L）/樣品重量（g）。

1.2.2遺傳分析。

1.2.2.1基因初定位。利用8272/9311F2群體中207個隱性單株作為初定位群體。選取多態(tài)性豐富的160對均勻分布在水稻12條染色體上的SSR引物對親本8272與9311的DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出在二者之間具有多態(tài)性的引物，隨后對通過集團(tuán)分離分析法構(gòu)建的黃化與綠色近等基因池，即在該F2群體抽穗期，選取正常綠色植株和葉尖黃化明顯的植株各10株，提取基因組DNA后各取等量混勻分別作為綠色和黃化近等基因池備用，進(jìn)行PCR分析，將在2個近等基因池上具有多態(tài)性差異的SSR標(biāo)記用于8272/9311F2群體中207個黃化隱性單株進(jìn)行遺傳分析，最后計算連鎖標(biāo)記與控制8272高溫光下葉尖黃化基因之間的遺傳圖距。

1.2.2.2精細(xì)定位。

首先，擴(kuò)大定位群體，最終該研究選用了8272/9311F2群體的1586個黃化單株用于精細(xì)定位。其次，在初定位區(qū)間進(jìn)行新SSR引物篩選，同時開發(fā)初定位目標(biāo)區(qū)段內(nèi)在8272與9311之間存在多態(tài)性的InDel標(biāo)記。

InDel標(biāo)記的開發(fā)是根據(jù)水稻粳稻品種日本晴與9311基因組序列比對之間已有的InDel差異位點找到在9311基因組中的對應(yīng)位點，然后在差異位點前后各取500bp的序列，利用引物設(shè)計軟件PrimerPrimer5.0設(shè)計新引物，合成后用于8272與9311之間的基因組擴(kuò)增、篩選，并把二者之間具有多態(tài)性差異的InDel引物用于交換單株的連鎖分析。

1.2.3候選基因篩選與測序驗證。

提取8272基因組DNA送安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司進(jìn)行全基因組重測序，測序深度要求50倍以上。然后比對8272和9311在精細(xì)定位結(jié)果的區(qū)段內(nèi)堿基序列，以及目標(biāo)區(qū)段內(nèi)SNP位點差異和所有基因的GO分析，篩選出候選基因;隨后對候選基因重新合成引物進(jìn)行差異位點的驗證，比較分析候選基因編碼區(qū)在8272與9311和日本晴之間是否發(fā)生堿基插入、缺失或替換。

2結(jié)果與分析

2.18272農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

2012年5月10日播種，6月10日移栽，水稻種質(zhì)資源8272在7月10日前與對照9311的葉色都表現(xiàn)為正常綠色，隨著南京梅雨季節(jié)的結(jié)束，日均溫和光照強(qiáng)度的逐漸升高，8272的所有新生葉尖開始變黃，并一直持續(xù)到整個生育期而不再發(fā)生轉(zhuǎn)綠現(xiàn)象;且環(huán)境溫光越高、越強(qiáng)，黃化性狀越明顯，而此時對照9311仍為正常綠色（圖1）;8272在苗期一般表現(xiàn)為綠色，但若在強(qiáng)光照條件下，也會表現(xiàn)出葉尖黃化現(xiàn)象。

2.2高溫光條件下8272色素含量

通過對比8272和9311葉片黃化前后幾種色素含量（表1）可以看到，8272的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量在不同發(fā)育時期都比9311略低，而在后期高溫高光強(qiáng)生長條件下更低：在黃化前，8272葉綠素的含量僅比9311低5.9%，類胡蘿卜素含量低3.9%;而在黃化后，8272葉綠素含量比9311低65.6%，類胡蘿卜素含量也低54.3%。由葉片顏色正常過渡到葉色黃化，8272葉綠素含量和類胡蘿卜含量均大幅度下降，分別下降63.4%和54.7%;而9311的葉綠素含量卻略有升高（升高1.1%），而類胡蘿卜素的含量也僅下降4.8%。在2個生長發(fā)育時期，8272的葉綠素與類胡蘿卜素的比值雖然均小于9311，但在抽穗期8272的比值下降了19.3%，而9311卻上升了6.1%。

2.3基因定位與候選基因篩選

8272與9311的正反交F1在整個生育期均表現(xiàn)為與9311一致的正常綠色。在8272/9311F2群體后期發(fā)生葉色分離，正常綠色植株和黃化葉色植株2018年分別為981和326株，2019年分別為4742和1586株。經(jīng)χ2檢驗（χ2<χ20.05=3.84;P>0.05），正常葉色與黃化葉色分離比在2年中均符合3∶1，說明8272在高溫光下葉尖逐步黃化的性狀受一個隱性核基因控制（表2）。

選取160對均勻分布在水稻12條染色體上多態(tài)性豐富的SSR引物，在親本9311與8272基因組之間進(jìn)行篩選，結(jié)果有36對引物在9311與8272基因組間表現(xiàn)出多態(tài)性。利用BSA法，將36對引物在黃、綠葉近等基因池上篩選，發(fā)現(xiàn)位于水稻第4染色體上的RM16335和RM17401這2個分子標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性差異，隨后用8272/9311F2群體中隨機(jī)選擇的207個黃化單株作為初定位的連鎖分析。根據(jù)已公布的公共數(shù)據(jù)庫中水稻SSR標(biāo)記，在RM16335與RM17401之間每間隔2～6cM選擇、合成引物進(jìn)行親本和近等基因池間的多態(tài)性篩選，并將滿足條件的引物進(jìn)行群體的PCR檢測與連鎖分析，初步將控制8272的高溫高光強(qiáng)葉尖黃化性狀的基因定位在標(biāo)記物理距離為13.8Mbp的RM16720與RM17401之間（圖2）。

為了對調(diào)控8272黃化性狀的目標(biāo)基因進(jìn)一步定位，該研究擴(kuò)大了種植8272/9311的F2群體。同時在初定位的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加密SSR引物，并選用PrimerPrimer5.0軟件不斷設(shè)計新的InDel標(biāo)記。2019年，選用了8272/9311的F2群體中1586個黃化單株進(jìn)行群體的分子檢測與連鎖分析，采用染色體步移法進(jìn)一步縮小目標(biāo)基因的定位區(qū)間，最終將目標(biāo)基因定位在物理距離約為117kb的SSR標(biāo)記RM16931與InDel標(biāo)記ID42之間（圖2）。

根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果，該研究首先確定RM16931和ID42在9311基因序列中的位置，然后結(jié)合8272重測序和9311基因組測序數(shù)據(jù)，通過一系列軟件對RM16931與ID42區(qū)間進(jìn)行二者間基因組DNA序列的SNP差異性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這2個引物區(qū)間內(nèi)有5個基因存在SNP差異位點，隨后對其GO分析，發(fā)現(xiàn)其中3個基因可能與8272的黃化表型有關(guān)。

根據(jù)9311基因組數(shù)據(jù)重新設(shè)計引物、擴(kuò)增、測序驗證發(fā)現(xiàn)，3個候選基因中只有BGIOSGA015140可能存在有義突變，而其他2個候選基因在9311與8272之間不存在非同義突變SNP位點。測序比對結(jié)果表明BGIOSGA015140基因在9311與8272之間存在3處SNP位點差異（圖3）：18029043處T-C堿基替換的結(jié)果是氨基酸同義突變（Tyr-Tyr）;18029050處G-A堿基替換導(dǎo)致氨基酸由纈氨酸（Val）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le），且這2處堿基替換均發(fā)生在基因的內(nèi)含子中;SNP位點（18029492）則位于BGIOSGA015140基因中第20個外顯子的編碼區(qū)（18029272～18029543），A-C堿基替換導(dǎo)致編碼的氨基酸由絲氨酸（Ser）變?yōu)楸彼幔ˋla）;絲氨酸是親水性的氨基酸，屬于極性中性氨基酸;而丙氨酸則是疏水性的氨基酸，屬于非極性氨基酸。由于氨基酸親、疏水性的改變可能會影響到蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，故推測BGIOSGA015140基因中SNP位點（18029492）A-C堿基的替換可能與8272的黃化表型有關(guān)。

3討論

8272在黃化表型上與其他葉色突變體有所區(qū)別。一些黃化表型僅在苗期表現(xiàn)，一些則隨著生育進(jìn)程以及后期溫度升高逐漸恢復(fù)為綠色，一些則在苗期就出現(xiàn)死亡現(xiàn)象[4-7，15-16]。突變體V5在氣溫低于24℃時表現(xiàn)為黃色，當(dāng)溫度高于26℃時又逐漸表現(xiàn)為綠色[17];突變體W4、W11在25℃時表現(xiàn)為黃色，而在30℃環(huán)境下則表現(xiàn)為白色[18];突變體cde1在23℃時表現(xiàn)為綠色，而在26℃時則表現(xiàn)為黃色[19]。8272在環(huán)境日均溫度低于25℃和中等強(qiáng)度光照時，葉尖表現(xiàn)為正常的綠色，而當(dāng)日均溫高于25℃和/或強(qiáng)光照（>30000lx）時，植株葉尖才開始黃化，且環(huán)境溫度越高和/或光照越強(qiáng)，黃化性狀越明顯;雖然在生長后期氣溫逐漸下降，但是黃化后的葉尖以及其后新生葉片葉尖都呈現(xiàn)出黃色，其黃化特征持續(xù)整個生育期。

控制8272葉色隨溫度變化的基因位置與已報道的黃化突變體有所不同。一些突變體在不同溫度條件下會發(fā)生表型的變化，如V5[17]，W4、W11[18]，cde1[19]等這些溫度敏感葉色突變基因位于水稻第3染色體;而該研究定位結(jié)果表明，調(diào)控8272葉色黃化的目標(biāo)基因則位于水稻的第4染色體上，故推測該基因可能是一個控制水稻葉色變化的新基因。

基因編碼區(qū)單個堿基的改變同樣也能導(dǎo)致水稻葉色的變化。突變體cde1在不同溫度環(huán)境下葉色變化的原因在于突變體內(nèi)編碼谷氨酰胺-tRNA合成酶OsGluRS基因編碼區(qū)內(nèi)一個蘇氨酸（Thr）被替換為一個脯氨酸（Pro）的錯義突變，結(jié)果導(dǎo)致高溫條件下突變體葉綠體發(fā)育不完整[19];突變體TCM5是由于基因LOC_Os05g34460編碼區(qū)內(nèi)一個核苷酸T替換為G，導(dǎo)致翻譯的氨基酸改變[20];yl1-1突變體是由于基因LOC_Os02g05890的第4個外顯子中有一個堿基由C替換為T，導(dǎo)致編碼的氨基酸由脯氨酸替換為絲氨酸[21];ygl8

突變體是由于基因LOC_Os01g17170有一個堿基由A突變?yōu)門，導(dǎo)致編碼的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸[22]，這些單個堿基的改變最終導(dǎo)致表型的變化。氨基酸的親、疏水性的變化及其相互作用對于維持蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)都具有重要影響[23-24]，因為氨基酸的親、疏水性的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水面積減小、蛋白折疊過于緊湊、主鏈張力過大、靜電力破壞等變化[25]。通過Blast、Clustal等軟件和候選基因GO分析發(fā)現(xiàn)，8272中BGIOSGA015140基因編碼區(qū)SNP變異位點（18029492）由堿基A突變?yōu)镃，導(dǎo)致編碼的氨基酸由疏水性的絲氨酸（Ser）突變?yōu)榉菢O性丙氨酸（Ala）;同時，對候選基因BGIOSGA015140上下游區(qū)域進(jìn)行GO分析，并未發(fā)現(xiàn)有已報道的與水稻黃化葉色相關(guān)的基因。因此，該研究把BGIOSGA015140列為調(diào)控8272在不同環(huán)境條件下葉尖顏色變化的候選新基因。

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