高 翔，徐 強，張榮華，魯 濤，潘伯駒，廖 泉

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1基本外科 2病理科，北京 100730

胰腺癌作為惡性程度最高的腫瘤之一，其總體5年生存率僅9%[1]。據(jù)報道，2015年中國新增胰腺癌患者約91 000人，死亡約79 400人，居所有因癌癥死亡人數(shù)的第5位[2]。目前手術(shù)和化療是胰腺癌的主要治療手段，但僅有15%～20%的患者有機會接受根治性手術(shù)，而且接受手術(shù)的患者5年生存率也不到25%[3]。而以吉西他濱為代表的化療常出現(xiàn)耐藥的情況，臨床療效有限。胰腺癌難治的根源包括高侵襲性的生物學(xué)行為、早期診斷的困難以及輔助治療手段的缺乏。研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機制和尋找相關(guān)治療靶點一直是胰腺癌的研究熱點?；チ鲅苌L因子1又稱Cripto- 1，是表皮生長因子CFC基因家族的成員之一，其在胚胎的早期發(fā)育，尤其是干細(xì)胞的再生、分化過程中發(fā)揮重要作用[4- 5]。研究表明在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等中Cripto- 1高表達(dá)，而在相應(yīng)正常組織中Cripto- 1不表達(dá)或低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Cripto- 1在腫瘤的早期診斷、靶向治療、預(yù)后評估等多方面有重要價值[6- 10]。在胰腺癌中，關(guān)于Cripto- 1的表達(dá)情況及其臨床意義的報道較少，本研究通過檢測Cripto- 1在正常胰腺和胰腺癌等相關(guān)組織中的表達(dá)情況，探討Cripto- 1表達(dá)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用并分析其臨床意義。

資料和方法

組織病理標(biāo)本組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，芯片編號為HPan-Ade060CD- 01、HPanA150Su01，采用的胰腺癌組織標(biāo)本均為本院2004年9月至2008年12月經(jīng)石蠟病理確診的胰腺導(dǎo)管腺癌。所有納入的病例滿足以下條件：(1)所有標(biāo)本均為手術(shù)切除后標(biāo)本；(2)術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為胰腺導(dǎo)管腺癌；(3)所有患者均未行新輔助放化療。采用國際抗癌聯(lián)盟第7版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行胰腺癌分期；按2010年WHO腫瘤分類消化分冊中的組織病理分級系統(tǒng)對胰腺癌分化程度進(jìn)行分級[11]。入組的共有85例胰腺癌組織標(biāo)本、70例癌旁標(biāo)本、4例胰腺癌轉(zhuǎn)移灶活檢標(biāo)本、12例胰腺癌手術(shù)獲取的淋巴結(jié)標(biāo)本、4例慢性胰腺炎標(biāo)本和4例正常胰腺組織標(biāo)本。所納入的患者均已簽署知情同意書，并且通過了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的審批。

免疫組織化學(xué)染色方法石蠟包埋切片標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，按抗體說明將切片浸入沸騰的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中微波爐解凍檔加熱修復(fù)抗原，使用生物筆進(jìn)行組織圈定后滴加3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次，滴加適量的Cripto- 1抗體(美國abcam公司，ab19917，1∶300稀釋)覆蓋切片，4℃條件下孵育過夜；PBS 沖洗3次，滴加即用型二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，滴加適量新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸顯色液，顯微鏡下觀察控制顯色時間；滴加蘇木素染液染色約1 min，PBS沖洗；經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢并拍照。

結(jié)果判定由與本研究無關(guān)的2名病理科醫(yī)師盲法觀片并采用半定量計分法完成。細(xì)胞質(zhì)不著色判為陰性，計0分，細(xì)胞質(zhì)著色判為陽性并按染色深度計分：淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；陽性細(xì)胞百分比計分：無陽性細(xì)胞計0分、1%～24%計1分、25%～49%計2分、50%～74%計3分、75%～100%記4分(陽性細(xì)胞百分比定義為3個任意高倍鏡視野下陽性細(xì)胞所占百分比的平均值)?？偡?染色深度計分×陽性細(xì)胞百分比計分)0～6分為低表達(dá)(0分為陰性表達(dá))，7～12分為高表達(dá)。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件(IBM，Armonk，NY，USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進(jìn)行分析；對于符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；對不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法計算累積生存差異，使用Log-rank檢驗比較不同組別的生存差異。多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。作圖軟件采用Graphpad Prism 6.0(GraphPad Software，San Diego，California，USA)。

結(jié) 果

一般資料共納入85例胰腺導(dǎo)管腺癌患者，男53例、女32例，平均年齡(62.1±10.6)歲(34～83歲)；37例TNM分期為Ⅰ期、48例為Ⅱ/Ⅲ期；胰頭癌49例、胰體尾癌36例；低分化者29例、中高分化者56例；中位隨訪時間10(1，36)個月(0～81個月)。

Cripto- 1的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)方法檢測85例胰腺癌組織標(biāo)本(其中70例有對應(yīng)癌旁組織)、4例正常胰腺組織標(biāo)本、4例慢性胰腺炎標(biāo)本、4例胰腺癌轉(zhuǎn)移灶活檢標(biāo)本、12例胰腺癌手術(shù)獲取的淋巴結(jié)標(biāo)本(8例陽性、4例陰性)中Cripto- 1的表達(dá)情況，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評分，結(jié)果顯示Cripto- 1主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)，少量表達(dá)于細(xì)胞核(圖1)。Cripto- 1在胰腺癌的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(Z=-3.164，P=0.002)。正常胰腺組織標(biāo)本和陰性淋巴結(jié)中Cripto- 1的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.316，P=0.752)，但低于胰腺癌(Z=-2.235，P=0.025)、慢性胰腺炎(Z=-2.352，P=0.019)、胰腺癌轉(zhuǎn)移灶(Z=-2.366，P=0.018)及陽性淋巴結(jié)(Z=-2.637，P=0.008)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

Cripto- 1表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系以χ2檢驗分析85例胰腺癌組織中Cripto- 1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果表明在低分化胰腺癌組織中Cripto- 1傾向于高表達(dá)，與中-高分化胰腺癌相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.934，P=0.015)。Cripto- 1表達(dá)水平與胰腺癌患者性別、年齡、腫瘤部位、T分期、N分期和TNM分期均無相關(guān)性(表1)。

A.陰性表達(dá)；B.低表達(dá)；C.高表達(dá)

NP：正常胰腺；CP：慢性胰腺炎；CA：胰腺癌；MT：轉(zhuǎn)移灶；PL：陽性淋巴結(jié)；NL：陰性淋巴結(jié)；與NP比較，a P=0.019，b P=0.025，c P=0.018，d P=0.008

Cripto- 1表達(dá)與胰腺癌患者的預(yù)后關(guān)系根據(jù)胰腺癌患者的Cripto- 1表達(dá)水平、年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、T分期、N分期等進(jìn)行分組，繪制Kaplan-Meier生存曲線，通過log-rank檢驗比較Cripto- 1不同表達(dá)組的生存差異，結(jié)果表明Cripto- 1高表達(dá)胰腺癌患者的中位生存期短于Cripto- 1低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(8個月比16個月，χ2=4.787，P=0.029)(圖3)。進(jìn)一步在不同性別、年齡、腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度的亞組中分析顯示，在N0分期患者(7個月比42個月，P=0.021)和女性患者(8個月比43個月，P=0.029)中，Cripto- 1高表達(dá)胰腺癌患者的中位生存期短于Cripto- 1低表達(dá)患者(圖4)。采用Cox回歸模型對Cripto- 1表達(dá)水平及胰腺癌患者相關(guān)臨床病理因素行單因素及多因素分析，結(jié)果表明腫瘤分化程度低(HR=2.444，95%CI=1.417～4.217，P=0.001)，TNM分期高(HR=2.328，95%CI=1.348～4.019，P=0.002)是胰腺癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素。單因素分析顯示Cripto- 1高表達(dá)是胰腺癌患者不良預(yù)后的危險因素(HR=1.716，95%CI=1.037～2.839，P=0.038)，但多因素分析未得出相同結(jié)論(表2)。

表1 胰腺癌患者Cripto- 1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 Cripto- 1表達(dá)與患者的Kaplan-Meier生存曲線

討 論

Cripto- 1在胰腺癌的相關(guān)研究較少，F(xiàn)riess等[12]和Tsutsumi等[13]早期的研究表明，Cripto- 1在正常胰腺組織中很少表達(dá)，而在慢性胰腺炎和胰腺癌組織中高表達(dá)，這與本研究的結(jié)果一致。Hong等[14]的研究顯示Cripto- 1在胰膽管型和胃型胰腺導(dǎo)管乳頭狀黏液瘤和交界性胰腺腫瘤中高表達(dá)。慢性胰腺炎和導(dǎo)管乳頭狀黏液瘤都是胰腺癌的高危因素和早期病變，這些都提示Cripto- 1可能在胰腺癌的早期發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3，15]。但Cripto- 1高表達(dá)在胰腺癌當(dāng)中的意義及對患者預(yù)后的影響目前尚無大樣本量的患者及長期隨訪的研究報道。

Cripto- 1在胚胎組織中高表達(dá)，而在成熟組織中幾乎不表達(dá)，Cripto- 1的不恰當(dāng)表達(dá)，就有可能促進(jìn)多種腫瘤生成[7，16- 17]。本研究顯示Cripto- 1在胰腺癌的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。值得一提的是，胰腺癌癌旁組織中Cripto- 1的表達(dá)水平也高于正常胰腺組織，這一特點可能和“區(qū)域性癌變”理論相關(guān)，即手術(shù)取下的胰腺癌標(biāo)本周圍組織盡管在形態(tài)學(xué)上看似正常，但已有早期致癌基因變化，已具有癌化的傾向[18]。

A.N0分期亞組患者；B.女性患者

表2 胰腺癌患者預(yù)后因素的Cox回歸分析

本研究顯示Cripto- 1與胰腺癌的分化程度相關(guān)，在低分化胰腺癌組織中Cripto- 1傾向于高表達(dá)。低分化的胰腺癌惡性程度更高，腫瘤惡性表型更明顯，預(yù)后更差，提示Cripto- 1的高表達(dá)可能與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的研究中，Cripto- 1與分化程度差、高TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等侵襲性腫瘤表現(xiàn)相關(guān)[7- 8，10，19]，均與本研究相似。

通過繪制Kaplan-Meier生存曲線及Cox回歸的方法進(jìn)行單因素分析顯示，Cripto- 1高表達(dá)是胰腺癌患者不良預(yù)后的危險因素，這與在其他多種惡性腫瘤中的發(fā)現(xiàn)一致[9- 10，20]，但在多因素分析中并未得出同樣的結(jié)論，可能與樣本量有限有關(guān)。另外，亞組分析顯示，N0分期患者和女性患者Cripto- 1高表達(dá)提示預(yù)后不良。胰腺癌在美國人群的男女比為1.1∶1，我國人群的男女比為1.4∶1[1- 2]，這一分布差異可能與激素的差異有關(guān)。Normanno等[21]研究顯示，在缺乏雌激素的瓊脂培養(yǎng)基中，低表達(dá)Cripto- 1的乳腺癌MCF- 7neo細(xì)胞和高表達(dá)Cripto- 1的MCF- 7CR- 1細(xì)胞均無法形成細(xì)胞集落，在加入雌激素后MCF- 7CR- 1細(xì)胞形成的集落較MCF- 7neo細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，提示雌激素可能與Cripto- 1存在協(xié)同作用；女性體內(nèi)較高水平的雌激素可能和Cripo- 1協(xié)同促進(jìn)胰腺癌的惡性生物學(xué)行為，導(dǎo)致預(yù)后不良，但具體機制尚待進(jìn)一步研究。

本研究的局限性有以下兩點。第一：本研究樣本量偏小，尤其是正常胰腺組織的標(biāo)本偏少，這與正常胰腺組織獲取困難有關(guān)。后續(xù)需要多中心大樣本量的研究驗證本研究的結(jié)論。第二：本文僅從免疫組織化學(xué)層面闡述Cripto- 1與胰腺癌的關(guān)系，具有一定局限性。后續(xù)本課題組將繼續(xù)從細(xì)胞和動物實驗層面進(jìn)一步探討Cripto- 1在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中的具體作用及其分子機制。

綜上，Cripto- 1在正常組織中幾乎不表達(dá)而在惡性組織中高表達(dá)，其在乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的動物種植模型中已被證實可作為一個新型標(biāo)志物和治療的靶點[22]。本研究首先闡述了Cripto- 1在胰腺癌中的表達(dá)特點及其臨床意義。Cripto- 1在胰腺正常組織中的表達(dá)水平顯著低于其在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)水平，提示Cripto- 1可能在胰腺癌的早期發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。同時，Cripto- 1在低分化胰腺癌組織中高表達(dá)，在N0患者和女性患者中，Cripto- 1高表達(dá)提示不良預(yù)后，對胰腺癌患者預(yù)后有一定指導(dǎo)意義。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量的臨床研究和深入分子機制的基礎(chǔ)研究具有重要的臨床意義。