盧麗香,周世友,曾海生,趙鳳仙,楊桂林,譚雨坪
(1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;2.廣西中醫(yī)藥大學,南寧 530200)
柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,別名茈胡、地薰。中國藥典規(guī)定柴胡(Bupleurum ChinenseDC.)或狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)為正品,供藥用,二者一般習稱為“北柴胡”及“南柴胡”[1]。藥用部分為柴胡的根或全草,具有解表和里、疏肝解郁、升提中氣之功效。主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、黃疸肝炎及月經(jīng)不調(diào)等[2]。
柴胡主要有效成分為柴胡皂苷、揮發(fā)油、黃酮、脂肪酸等成分[3]。目前已經(jīng)從柴胡不同部位分離到柴胡皂苷(saikosaponins)a~d 等[4]。研究表明,柴胡皂苷具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性[5],柴胡皂苷a、d為其主要活性成分,并且柴胡皂苷 d 的藥理活性最強[6,7]。本研究采用高效液相色譜法,以蒸發(fā)光散射檢測器進行檢測,對柴胡藥材中柴胡皂苷c、a、d 進行了含量測定,以建立測定柴胡根3 種皂苷含量的分析方法。
1.1.1 儀器 2695 型高效液相色譜儀(美國Waters公司,包含2489UV、四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3 液相工作站);Alltech ELSD 2000ES 型蒸發(fā)光檢測器、純水儀(法國Millipore 公司);電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);TGL-16G 型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);KQ5200V 型超聲清潔器(昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)。
1.1.2 藥物與試劑 柴胡皂苷c(批號:20191015)、柴胡皂苷a(批號:20190812)、柴胡皂苷d 對照品(批號:20190914),純度>98%,均購自寶雞市辰光生物科技有限公司,氨水(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司),甲醇、乙腈(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司),水為去離子水。
柴胡為傘形科植物柴胡(Bupleurum chinenseDC)或“狹葉”柴胡(B.scorzonerifoliumWi11d)的干燥根莖(購自廣東康美藥業(yè)有限公司,批號20190418)。
1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱:Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-水,梯度洗脫(表1),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD),進樣量為10 μL。
表1 HPLC 梯度洗脫條件
1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取柴胡藥材粉末(過2 目篩)1.0 g,置于150 mL 具塞錐形瓶中,加入體積比為10%的氨水-甲醇溶液25 mL,超聲提取45 min,過濾,用甲醇洗滌錐形瓶,在通風櫥中62 ℃水浴揮干,殘渣加甲醇溶解,定容于5 mL 容量瓶中。
1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷c、a、d 對照品9.52、10.14、15.28 mg,加甲醇適量使溶解,并定容至10 mL容量瓶中,得到含柴胡皂苷c、a、d分別為0.952、1.014、1.528 mg/mL 的混合對照品溶液。
2.1.1 線性關(guān)系考察 精密吸取柴胡皂苷混合對照品溶液 2、5、8、10、12、15、20 μL 分別注入高效液相色譜儀,測定相應條件下的峰面積。以峰面積為縱坐標,以進樣量(μg)為橫坐標,制得標準曲線并計算相對應的回歸方程。精密吸取上述柴胡皂苷混合對照品稀釋液進樣,測定其信號(以峰高計算)與噪聲比值,將S/N=3 時的濃度定為檢測限(LOD),將S/N=10 時的濃度定為定量限(LOQ)。各組分在各自的含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,結(jié)果如表2 所示。
表2 線性方程及線性范圍
2.1.2 精密度試驗 精密稱取中藥柴胡粉末1.0 g,按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣,連續(xù)進行6 次,并計算柴胡皂苷a 面積的RSD(%)、柴胡皂苷c面積的RSD(%)、柴胡皂苷d面積的RSD(%)。結(jié)果表明,柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 的RSD分別為 1.27%、1.05% 和 0.58%,RSD均小于3.0%,表明所用液相色譜儀的精密度較好。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗 分別于在 0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣,測定各供試品的峰面積。結(jié)果表明,柴胡中的柴胡皂苷a 峰面積的RSD為1.23%、柴胡皂苷c 峰面積的RSD為0.85%、柴胡皂苷d 峰面積的RSD為1.62%,均小于3.0%,說明供試品在24 h 內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性。
2.1.4 重復性試驗 精密稱取6 份柴胡藥材粉末(過2 目篩)1.0 g,測定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d 的平均含量。結(jié)果表明,柴胡中柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的平均含量分別為0.954、0.982、1.826 mg/g;柴胡中柴胡皂苷 a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 含量的RSD分別為2.08%、2.42%、1.54%,均小于3.0%,表明該方法重復性良好。
2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取9 份柴胡藥材粉末0.5 g,分成低、中、高加樣組(0.5 g 藥材含量的80%、100%、120%加樣),每組分別加入混合對照品溶液(柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d),計算柴胡低、中、高加樣組中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 的平均回收率及其RSD。從表3 可以看出,該方法準確性良好。
表3 柴胡加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)
2.1.6 專屬性試驗 精密吸取甲醇溶劑10 μL,注入液相色譜儀,按上述方法進行測定,在測定時間內(nèi)沒有色譜峰出現(xiàn),說明甲醇溶劑不影響柴胡皂苷的測定,方法的專屬性良好,甲醇溶劑的色譜見圖1。
圖1 甲醇HPLC 色譜
精密吸取混合對照溶液1 mL,置于5 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度線,搖勻,分別精密吸取5和10 μL。結(jié)果表明,柴胡皂苷c、a、d 的保留時間分別為7.4、17.8、29.1 min(圖 2)。
圖2 柴胡皂苷混合對照品HPLC 色譜
精密稱定3 份柴胡藥材粉末1.0 g 過2 目篩,按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣,通過外標一點法計算柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量,結(jié)果見表4。
表4 柴胡樣品含量測定結(jié)果
本研究建立的高效液相色譜法測定柴胡中柴胡皂苷c、a、d 的含量操作簡便、準確度高、精密度好,3種柴胡皂苷的色譜峰和試樣中其他組分的色譜峰可達基線分離,且分離度、峰型較好,可以作為柴胡皂苷c、a、d 的含量測定方法。