王春花，孫雪芳

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000）

脂肪肝是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為主要特征的病理綜合征，為圍產(chǎn)期奶牛和籠養(yǎng)蛋雞的常見(jiàn)疾病，發(fā)病率分別為10%～50%和5%～30%，病死率為25%和10%［1-3］，不僅對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，也嚴(yán)重影響了寵物與人類(lèi)的健康。全球人類(lèi)非酒精性脂肪（NAFLD）肝患病率高達(dá)25.24%［4］，在中國(guó)非酒精性脂肪肝已經(jīng)替代乙型肝炎成為最常見(jiàn)的慢性肝?。?］，有效防治脂肪肝已成為保障養(yǎng)殖業(yè)、寵物與人類(lèi)公共健康的重大課題。目前治療脂肪肝的手段相對(duì)比較局限，可應(yīng)用的有效藥物更是匱乏，臨床發(fā)現(xiàn)通過(guò)改善飲食、減少環(huán)境應(yīng)急結(jié)合降脂類(lèi)中藥可以降低脂肪肝發(fā)病率［6-8］，找到一種無(wú)毒、價(jià)廉、高效預(yù)防脂肪肝的新型飼料添加劑成為有效控制脂肪肝的關(guān)鍵。

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides）是中藥黃芪的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、改善腸道菌群、降脂、降糖等作用［9-11］，可作為動(dòng)物飼料添加劑以提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)、緩解熱應(yīng)激和提高動(dòng)物免疫功能［12-14］。黃芪多糖因其廣泛的抗菌、抗病毒作用，常被作為抗生素的替代品用于動(dòng)物疫病的防治［15-17］，避免了抗生素濫用引起的藥物殘留和耐藥性的產(chǎn)生，通過(guò)黃芪多糖替代抗生素來(lái)防治動(dòng)物疫病成為目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可降低高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪病變程度［18］，顯著降低泌乳期奶牛血清甘油三酯（TG）含量［19］，但其機(jī)制并不清楚，還有待研究揭示。Toll 樣受體4（TLR4）在脂肪肝發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用［20］，通過(guò)調(diào)控TLR4 干預(yù)脂肪肝已成為目前防治脂肪肝研究的熱點(diǎn)［21］。研究顯示，黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)控TLR4 抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大［22］和慢阻肺炎癥反應(yīng)［23］，黃芪多糖干預(yù)肝臟脂肪變性是否與調(diào)控TLR4 有關(guān)并未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)高脂結(jié)合果糖飲食誘導(dǎo)脂肪變性小鼠模型觀察黃芪多糖的預(yù)防作用，并通過(guò)檢測(cè)腸道通透性與肝臟TLR4 和MyD88 蛋白的表達(dá)探討黃芪多糖對(duì)脂肪變性小鼠的預(yù)防機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)ICR 小鼠30 只［購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-001］，雄性，8 周齡，體質(zhì)量30～33 g，飼養(yǎng)于牡丹江師范學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 高脂飼料為自制；黃芪多糖購(gòu)于廣東紅泰生物科技有限公司；HE 染色試劑盒購(gòu)于江蘇綠葉生物科技有限公司，4 kD 熒光素標(biāo)記葡聚糖購(gòu)于Sigma 公司；TLR4 與MyD88 抗體購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 生化分析儀（U-8021A 型，桂林優(yōu)利特有限公司）、離心機(jī)（H2500R 型，湖南湘儀離心機(jī)有限公司）、電子天平（AX523ZH 型，西杰天平儀器有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與樣本采集 30 只雄性ICR 小鼠隨機(jī)分成3 組，每組10 只，分為正常組、模型組、黃芪多糖預(yù)防組（400 mg/kg）。適應(yīng)性喂養(yǎng)動(dòng)物1 周后，除正常組喂食普通飼料外，其余各組小鼠均飼喂高脂飼料與30%果糖水8 周，飲水自由攝取。造模同時(shí)小鼠每日按400 mg/kg 劑量灌胃黃芪多糖，給藥體積為0.5 mL/30 g體質(zhì)量，正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥8 周。

在第8 周最后一次給藥后，各組小鼠禁食12 h，各組隨機(jī)選取5 只小鼠按0.6 mg/g 體重灌胃熒光素標(biāo)記葡聚糖（FITC-Dextran，4 kD）的溶液，4 h 后稱(chēng)體質(zhì)量，眼球采血，4 ℃1 500 r/min離心10 min分離血清（未灌胃FITC-Dextran 溶液小鼠），4 ℃ 4 000 r/min離心10 min分離血漿（灌胃FITC-Dextran溶液小鼠），-80 ℃保存，用于血清與血漿相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。采血后頸椎脫臼處死小鼠，解剖觀察肝臟外觀，稱(chēng)重后肝臟組織石蠟包埋，肝臟組織余下部分存于-80 ℃，用于肝臟組織TLR4 蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

1.2.2 一般指標(biāo) 每周對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定與記錄，計(jì)算肝臟指數(shù)，觀察各組小鼠皮毛光澤和精神狀態(tài)，小鼠肝臟指數(shù)計(jì)算公式如下：

肝臟指數(shù)=［小鼠肝臟質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）］×100%

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)的檢測(cè) 小鼠處死后，解剖觀察并記錄肝臟外觀形態(tài)與病變情況。肝臟組織以10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，制備肝臟組織切片，HE 染色后在光鏡下觀察肝臟脂肪變性程度。

1.2.4 血清生化指標(biāo)與血漿中FITC-Dextran 的檢測(cè) 采用生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和葡萄糖（GLU）。

利用多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)光波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm）測(cè)定FITC-Dextran 標(biāo)準(zhǔn)品與血漿中FITC-Dextran 的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算血漿中FITC-Dextran 含量。

1.2.5 肝臟組織中TLR4、MyD88蛋白水平的檢測(cè) 肝臟組織放于RIPA蛋白裂解液中研磨裂解，13 000 r/min離心15 min，取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)膜，TBS 沖洗后加 5%BSA 封閉，振蕩培養(yǎng) 2 h，洗膜、加入 TLR4、MyD88 一抗稀釋液置 4 ℃過(guò)夜，洗膜、加HPR 標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫培養(yǎng)2 h，洗膜、滴加ECL 放置培養(yǎng)1 min，顯色后利用Image Quant Las 4 000 mini 拍照并分析條帶灰度值。以TLR4、MyD88 和β-actin 條帶灰度值的比值作為T(mén)LR4、MyD88 的表達(dá)水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0 軟件分析處理，結(jié)果以表示，采取組間t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著，P＜0.01 表示各組數(shù)據(jù)間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般指標(biāo)情況

正常組小鼠體重穩(wěn)定增加，行為活躍，精神狀態(tài)好。模型組小鼠體重快速增加，體型肥胖，不喜歡活動(dòng)，時(shí)有發(fā)蔫現(xiàn)象發(fā)生。黃芪多糖預(yù)防組小鼠體重緩慢增加，小鼠體型類(lèi)似正常組，精神狀態(tài)良好。從表1 可以看出，與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量（P＜0.05），肝濕重（P＜0.01）和肝臟指數(shù)（P＜0.05）顯著增加；與模型組比較，黃芪多糖預(yù)防組小鼠體重（P＜0.05）和肝濕重（P＜0.01）顯著降低。解剖后觀察小鼠肝臟形態(tài)，模型組小鼠肝臟外觀顏色變黃油膩，對(duì)比模型組與正常組，黃芪多糖預(yù)防組小鼠肝臟外觀顏色更接近正常組，說(shuō)明黃芪多糖預(yù)防后肝臟脂肪變性程度有所緩解（圖1）。

表1 各組小鼠體重、肝濕重和肝臟指數(shù)比較

圖1 小鼠解剖狀態(tài)

2.2 黃芪多糖對(duì)小鼠肝功能與血脂血糖水平的影響

如圖2 所示，對(duì)比正常組，模型組小鼠血清ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.01）和 ALP（P＞0.05）水平均升高；對(duì)比模型組，黃芪多糖預(yù)防組小鼠血清ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.05）和 ALP（P＞0.05）水平均降低。對(duì)比正常組，模型組小鼠血清GLU（P＜0.05）、TC（P＜0.01）和 TG（P＞0.05）水平升高。對(duì)比模型組，黃芪多糖預(yù)防組小鼠GLU（P＜0.05）、TC（P＜0.05）和TC（P＜0.05）水平均顯著降低。對(duì)比正常組，模型組小鼠血清LDL（P＜0.01）和HDL（P＜0.01）明顯升高。對(duì)比模型組，黃芪多糖預(yù)防組小鼠LDL（P＞0.05）和HDL（P＜0.01）升高。

2.3 黃芪多糖對(duì)小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3 所示，正常組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心肝細(xì)胞呈放射性排列，邊界清晰，未見(jiàn)明顯病變。在肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，胞內(nèi)胞質(zhì)均勻，無(wú)脂肪滴堆積，無(wú)肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性現(xiàn)象。模型組小鼠肝細(xì)胞界限模糊不清，排列混亂，體積增大、腫脹，脂肪滴彌漫性浸潤(rùn)，可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)大小、數(shù)量不均的脂滴空泡存在。黃芪多糖預(yù)防組小鼠肝臟的脂肪浸潤(rùn)程度顯著下降，肝細(xì)胞排列緊密，黃芪多糖預(yù)防給藥可減少高脂高糖誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性程度，減少肝臟內(nèi)脂肪的積累。

圖2 小鼠血清中ALT、AST、ALP、TG、TC、GLU、LDL 和 HDL 的 表達(dá) 水 平

圖3 小鼠肝臟組織病理（100×）

2.4 黃芪多糖對(duì)小腸通透性的影響

如圖4 所示，對(duì)比正常組，模型組小鼠血漿中FITC-Dextran 含量較正常組小鼠含量顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明模型組小鼠腸道通透性增加。對(duì)比模型組，黃芪多糖預(yù)防組小鼠血漿中含量下降，接近于正常小鼠，表明黃芪多糖能有效減小腸道通透性，改善腸道屏障。

圖4 小鼠血漿中FITC-Dextran 的含量

2.5 黃芪多糖對(duì)肝臟TLR4 與MyD88 蛋白表達(dá)的影響

如圖5 所示，對(duì)比正常組，模型組小鼠肝臟中TLR4 蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖預(yù)防組小鼠肝臟TLR4 蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）。對(duì)比正常組，模型組小鼠肝臟中MyD88 蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖預(yù)防組小鼠肝臟MyD88 蛋白表達(dá)量極顯著減少（P＜0.01），接近于正常組小鼠MyD88 蛋白表達(dá)量。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究黃芪多糖預(yù)防給藥對(duì)肝臟脂肪變性的干預(yù)作用，為黃芪多糖作為新型添加劑用于預(yù)防高危時(shí)期動(dòng)物脂肪肝的發(fā)生提供基礎(chǔ)。研究顯示，TG、GLU、AST 等可用于綿羊、奶牛脂肪肝發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估［24，25］，臨床上也常檢測(cè) TG、TC、ALT 和AST 水平用于脂肪肝診斷。結(jié)果顯示，預(yù)防組小鼠肝臟脂肪病變程度明顯減輕，血清指標(biāo)ALT、AST、ALP、TG、TC 和 GLU 水平顯著降低，以上結(jié)果與唐姣玉等［10］報(bào)道的黃芪多糖干預(yù)大鼠高脂模型的血清生化指標(biāo)、泌乳期奶牛血清TG 指標(biāo)一致，說(shuō)明預(yù)防給藥黃芪多糖對(duì)飲食誘導(dǎo)引起的肝臟脂肪變性具有抑制作用，添加在飼料中可干預(yù)動(dòng)物脂肪肝的發(fā)生［26］。

圖5 小鼠肝臟TLR4 和MyD88 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

脂肪肝的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未闡明，Tilg等［20］提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)被認(rèn)為是人類(lèi)NAFLD發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說(shuō)，隨著研究的深入，由胰島素抵抗、腸道菌群失調(diào)、免疫改變等組成的“多重打擊”被越來(lái)越多學(xué)者支持，為動(dòng)物脂肪肝發(fā)病機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)與方向。TLR4在“多重打擊”過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括依賴(lài)性MyD88 和非依賴(lài)性MyD88 兩條通路，在依賴(lài)性MyD88 途徑中，TLR4 與特異性配體相互識(shí)別后，通過(guò)直接接觸或間接募集的方式活化MyD88，激活I(lǐng)KK/NF-κB 及絲裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)途徑，引起炎性介質(zhì)合成與釋放，促進(jìn)肝內(nèi)脂肪堆積，胰島素抵抗，炎癥和纖維化過(guò)程參與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展［27-29］。黏膜屏障功能下降，腸道通透性增加，可導(dǎo)致腸源性脂多糖LPS 隨血液經(jīng)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，與脂多糖受體LPB、CD14 結(jié)合形成三元復(fù)合物，激活肝臟TLR4 相關(guān)信號(hào)通路。肝內(nèi)TLR4 激活后通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪代謝酶如SCD1、CPT-1、ACOX1 等，使肝臟脂肪合成增加，促進(jìn)了脂質(zhì)積累和脂肪變性的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可有效預(yù)防飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝的發(fā)生，黃芪多糖預(yù)防給藥后模型小鼠腸道通透性減小，肝臟TLR4 和MyD88 蛋白表達(dá)水平下降，這些結(jié)果提示黃芪多糖很可能是通過(guò)改善腸道屏障，減少腸源性TLR4 激活物進(jìn)入肝臟激活TLR4，抑制TLR4/MyD88 通路介導(dǎo)的肝內(nèi)脂肪堆積過(guò)程，減小肝臟脂肪變性程度，從而發(fā)揮預(yù)防脂肪肝作用。同時(shí)，下調(diào)肝臟TLR4 蛋白的表達(dá)還可以抑制腸源性L(fǎng)PS 激活介導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)通路和神經(jīng)酰胺/pkcθ 信號(hào)通路，通過(guò)減少細(xì)胞因子和趨化因子的合成與釋放、抑制IRS1/2 的絲氨酸磷酸化和蛋白質(zhì)體降解預(yù)防脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展。