邱 晨 ，姜 濤，陳修報 ，劉洪波 ，楊 健 ，

（1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇 無錫 214081）

人工增殖放流是一項以養(yǎng)護水生生物資源、修復水域生態(tài)環(huán)境、促進漁民增收、振興漁業(yè)經(jīng)濟為目標的國策。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所制定的《2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展工作要點》也將該工作列為“著力強化漁業(yè)資源養(yǎng)護修復”的重要內(nèi)容。為有效掌握資源魚類的增殖放流效果，開發(fā)及優(yōu)化放流標記和跟蹤評估技術(shù)具有十分重要的意義，但同時也是開展經(jīng)濟、珍稀水生生物物種增殖放流及其效果評價工作中的難點課題。

值得注意的是，由于鍶（Sr）的代謝與鈣（Ca）相似，容易被硬骨組織吸收和保留，且早期生活史階段的魚體對 Sr 的吸收和積累效應(yīng)更明顯［1］；因此，Sr 元素被認為可用于仔稚魚等個體耳石化學標記的安全有效的標記工具［2］，與傳統(tǒng)標記技術(shù)相比，Sr 標記因其具有操作簡單、成本低、對魚干擾少等優(yōu)點［3］而備受關(guān)注，也已成為研究熱點之一。迄今，多種魚類的耳石 Sr標記已取得了成功［4-11］。

如果創(chuàng)建的標記可以在標志魚的整個生命周期中存在，那該標志技術(shù)的價值就能顯著增加［12］。若耳石上所形成的Sr 標記可以永久保存的話，無疑將具有客觀地區(qū)別于非標記魚，且評價增殖放流生態(tài)效果價值。由于耳石具有代謝惰性，元素一旦被沉積到耳石上，就可能存在于魚類的整個生活史，不會被代謝或消失，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)有針對外源Sr 標記在耳石可存留最長時間的研究報道。為此，本研究以鯉（Cyprinus carpio）仔魚為試驗對象，在已證明Sr可以作為其安全有效標記物的基礎(chǔ)上［13，14］，對其進行有針對性的高Sr 標記試驗，再經(jīng)過長時間的恢復續(xù)養(yǎng)，探究Sr 標記在其3 對耳石（即矢耳石、微耳石和星耳石）上的標記效果及保持情況，并比較篩選出最適合作為長期Sr 標記研究的耳石類型，以期能為破解和評價鯉科魚類耳石Sr 標記的持久性，更好地發(fā)展及優(yōu)化相關(guān)耳石Sr 標記技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚于2017 年4 月26 日采自江蘇省無錫市中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南區(qū)實驗基地人工繁殖的健康鯉仔魚（14 日齡）［15］。試驗標記溶液為10 mg/L 六水氯化鍶（換算成Sr2+的濃度為3.3 mg/L）（SrCl2·6H2O，分析純，上海撫生實業(yè)有限公司）溶液。

1.2 浸泡標記與檢測

1.2.1 試驗設(shè)計與樣本采集方案 標記前，試驗魚在100 cm×45 cm×50 cm 玻璃缸內(nèi)空腹暫養(yǎng)1 d，以減少標記期間代謝消耗。2017 年 4 月 29 日 17：30，隨機挑選300 尾試驗魚（全長為8～10 mm）放入標記溶液中空腹標記2 d，標記期間不斷向水體充氧。2017年 5 月 1 日 17：30，將試驗魚分別置于盛有 100 L 曝氣自來水的玻璃缸（規(guī)格同上）中續(xù)養(yǎng)恢復，期間進行正常投喂，每日清理排泄物及換水1 次，換水量占養(yǎng)殖水體的1/4。整個試驗不控溫度和光周期。

為開展鯉仔魚耳石上鍶標記的持久性探索，從上述試驗魚中選養(yǎng)1 尾，一直恢復續(xù)養(yǎng)至2018 年12月29 日（607 d，即20 個月），且于當天17：30 時進行了該魚的活體取樣，并解剖摘取其3 對耳石。

1.2.2 耳石的摘取與檢測 在解剖鏡下取出鯉魚3對耳石，即矢耳石、星耳石和微耳石（圖1），用去離子水去除耳石表面有機雜質(zhì)，自然晾干。用環(huán)氧樹脂（Epofix，Struers 公司）進行包埋，用碾磨機（Disco?plan-TS 型，Struers 公司）初、精磨至核心標記，再將其用磨拋機（LaboPol-35，Struers公司）將其拋光至核心完全標記在表面且耳石表面無明顯劃痕。測定前，耳石樣本用去離子水超聲清洗，完全干燥后，用真空鍍膜機（JEE-420，日本電子株式會社）鍍膜（36 A，25 s）。利用X 射線電子探針微區(qū)分析儀（EPMA，簡稱電子探針，JXA-8100 型，日本電子株式會社，下同），分別對3 對耳石（矢耳石和微耳石為過核心的矢狀面，星耳石為過核心的橫截面）進行定量線和面分布分析［16，17］。

圖1 六水氯化鍶溶液中浸泡標記2 d 后再恢復續(xù)養(yǎng)607 d 時鯉仔魚及其3 對耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）形態(tài)

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進行匯總及作圖。定量線分布數(shù)據(jù)用Sr 含量和Ca 含量的比值來表示，耳石上不同區(qū)域Sr/Ca 比值用平均值±標準差表示，由于耳石中Sr 含量遠小于Ca 含量，按慣例將Sr/Ca 標準化，即統(tǒng)一用（Sr/Ca）×103來表示，簡稱Sr/Ca 比值。

2 結(jié)果與分析

電子探針微區(qū)分析所獲面分布結(jié)果顯示，經(jīng)10 mg/L SrCl2·6H2O 標記，再經(jīng)過長達 20 個月的恢復續(xù)養(yǎng)后，鯉仔魚3 對耳石上呈現(xiàn)出不同的標記特征。微耳石和矢耳石上仍可觀察到紅色高Sr 含量標記區(qū)（圖2）。定量線分布結(jié)果也證實，星耳石、微耳石和矢耳石上均出現(xiàn)了明顯的一個Sr/Ca 比值標記峰，峰值分別9.62、9.53、7.84（圖3）。

圖2 恢復續(xù)養(yǎng)607 d 時鯉仔魚3 對耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）上的鍶標記圖譜

圖3 恢復續(xù)養(yǎng)607 d 時鯉魚3 對耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）從核心（0 μm）到邊緣定量線分析所獲Sr/Ca 比值圖譜

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)標志法，如掛牌法、剪鰭法、染色法等［18］，雖在國際上應(yīng)用廣泛，但都存在標記易丟（消）失或保存率較低的“瓶頸”［19］，而確保標志或標記的持久性是衡量一項放流標志技術(shù)價值的重要指標［12，20］。由于耳石Sr 標記的可檢測性和持久性，使其具有可獲取耳石上精確的標記及其持續(xù)保持時間參數(shù)的潛力。

魚類耳石Sr 標記技術(shù)的研究是基于耳石代謝惰性這一特性來實現(xiàn)的。王臣等［7］對大麻哈魚（On?corhynchus keta）發(fā)眼卵后期胚胎進行不同濃度Sr 浸染試驗中，經(jīng)100 d 恢復續(xù)養(yǎng)后，矢耳石上Sr 峰值仍清晰可測，說明Sr 標記在矢耳石至少能存在100 d。Steven 等［21］利用 5 000 mg/L SrCl2標記紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）魚苗，恢復續(xù)養(yǎng) 21 個月時，其矢耳石上的高Sr 部位能明顯被檢測到。Morales-Nin 等［22］經(jīng) Sr 肌肉注射標記的鱸形目尾斑重牙鯛（Diplodus annularis）和紋首鮨（Serranus scriba）個體在續(xù)養(yǎng)277～366 d（近12 個月）后，耳石上均可檢測出Sr 標記信號。同樣，本研究證實了在鯉仔魚階段利用 Sr 溶液 2 d 標記后，經(jīng)過長達 607 d（20 個月）的續(xù)養(yǎng)，3 對耳石上紅色高Sr 含量標記環(huán)均清晰存在；Sr/Ca 比值標記峰值也非常明顯。這說明Sr 均可有效標記鯉星耳石、微耳石、矢耳石三類耳石達640 d以上，具顯著的持久性。從Sr 標記圖譜區(qū)域范圍、含量水平和Sr/Ca 比標記峰值綜合來看，星耳石能更為清晰地反映Sr標記持久性的效果。

本研究證實即使經(jīng)過607 d 的長期續(xù)養(yǎng)恢復后，其星耳石、微耳石、矢耳石上沉積形成的高Sr含量及高Sr/Ca 比值峰值“標記”區(qū)域仍可清晰留存。這種現(xiàn)象的存在顯示出耳石Sr標記應(yīng)該具有明顯的持久性，也進一步印證了耳石Sr 標記技術(shù)的優(yōu)勢。在此基礎(chǔ)上，需要增加相關(guān)工作的耳石樣本量及加長標記魚的恢復續(xù)養(yǎng)時間，來進一步確認上述標記持久性的普適性，以便為魚類增殖放流服務(wù)和相關(guān)基準/標準的研發(fā)提供更系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。